近江牡蛎（Crassostrea ariakensis）隶属于双壳纲（Bivalvia）,珍珠贝目（Pterioida）,牡蛎科（Ostreidae）,巨蛎属（Crassostrea）,是我国重要的海水经济贝类。糖原是牡蛎体内最直接有效的储能物质,也是影响牡蛎肉质肥美的主要呈味物质之一,其含量的高低直接影响到牡蛎的风味和营养品质,常作为牡蛎肉质性状重要的评判标准。本实验室前期已明确了山东东营近江牡蛎群体不同组织糖原含量的季节变动规律及其与性腺发育的关系,为进一步探究糖原代谢调控机制,本研究首先在微量蒽酮比色法测定糖原含量的基础上,建立了近江牡蛎6个组织及全软体部的糖原含量近红外检测模型,便于实现近江牡蛎糖原含量的快速测定;然后对近江牡蛎五个发育时期的卵巢进行了比较转录组分析,筛选出糖原代谢通路上的关键基因糖原合酶（GS）、糖原合酶激酶3β基因（GSK3β）,对其编码区进行了验证和生物信息学分析,并采用荧光定量和原位杂交技术测定了这两个基因在各组织的时空表达规律及其与糖原含量的关系;最后通过RNA干扰技术沉默GSK3β基因,探究了该基因对GS基因的调控作用。本研究丰富了近江牡蛎品质性状快速测定方法和糖原代谢关键基因研究内容,为后续近江牡蛎糖原代谢调控机制的研究提供了参考数据。主要研究内容及结果如下:1.近江牡蛎冻干组织糖原含量近红外模型的建立采用微量蒽酮法、近红外技术分别获取了近江牡蛎外套膜、鳃、闭壳肌、肝胰腺、唇瓣、性腺等6个组织及全部软体部混样共909份样品的糖原含量及光谱数据,结合最小二乘法建立了近江牡蛎6个组织及全软体部的糖原含量预测模型,并对该模型进行了外部验证和交叉验证。结果表明,所测样品光谱数据经一阶求导、乘法散射校正及平滑预处理后,建立的模型最优;所建立的7个模型的建模相关系数（RC）为0.9716-0.9963,其外部验证相关系数（REV）以及交叉验证相关系数（RCV）分别为0.9490-0.9908和0.9694-0.9969,且模型交叉验证和外部验证的RPD值均大于2.5,表明所建立的模型能准确预测近江牡蛎相应组织样品的糖原含量。本研究建立的7个糖原含量NIR分析模型,可以实现近江牡蛎外套膜、鳃、闭壳肌、肝胰腺、唇瓣、性腺及全软体部冻干组织样品中糖原含量的快速准确、大批量测定,丰富了近江牡蛎品质性状的检测方法,为牡蛎品质性状改良等方面的研究提供技术支撑。2.近江牡蛎卵巢五个发育时期转录组分析及糖原代谢关键基因的挖掘对近江牡蛎形成期、增殖期、成熟期、排放期、耗尽期的15个卵巢样品进行转录组测序与分析,结果表明,每个样品平均产出6.11Gb数据,基因组的平均比对率为73.58%,共检测到基因数为27,266,其中已知的基因为25,327个,预测的新基因为1,950个,共检测出47,758个新转录本;对相邻发育时期的卵巢进行差异表达基因分析,发现增殖期VS成熟期组和排放期VS耗尽期组的差异基因聚类呈相反变化,且差异基因显著聚类在这两组中;将所有的DEG进行KEGG富集分析,发现20条显著富集的通路（P＜0.05）,其中“淀粉和蔗糖代谢”、“糖酵解/糖异生”、“胰高血糖素信号通路”、“胰岛素信号通路”是最具代表性的,且均与糖原代谢相关;将筛选出的10个与糖原代谢、卵巢发育相关的基因进行转录组验证,发现这些糖原代谢关键基因在五个发育时期表达量变化与糖原含量存在一定的相关性,其中包括GS、GSK3β基因;对GS、GSK3β基因编码区序列进行验证和生物信息学分析,发现GS、GSK3β的编码区分别为2094 bp、1242 bp,分别编码697和413个氨基酸,且氨基酸序列与其他动物的同源序列均具有高同源性。研究结果为近江牡蛎糖原含量季节性变化的分子机制研究提供了参考资料。3.糖原合酶、糖原合酶激酶3β基因的时空表达规律研究利用原位杂交技术研究了GS、GSK3β基因在这6种组织中的细胞学定位,结果显示,GS、GSK3β基因在外套膜、鳃、闭壳肌、肝胰腺、唇瓣、性腺组织的细胞质中均检测到阳性信号;GS在性腺和肝胰腺组织中阳性信号强,而GSK3β在鳃组织中阳性信号最强。通过q RT-PCR技术对近江牡蛎GS、GSK3β基因在五个不同性腺发育时期的外套膜、鳃、闭壳肌、肝胰腺、唇瓣、性腺等组织的表达进行了检测。结果显示,GS、GSK3β基因在这六个组织中均有表达,且GS均在成熟期表达量最低（P＜0.05）,而GSK3β在成熟期表达量最高（P＜0.05）;基因在不同发育时期的6个组织表达变化趋势基本一致,且与对应发育时期糖原含量的变化趋势有一定的相关性;在增殖期,鳃和闭壳肌组织的GS相对表达量和糖原含量明显低于其它组织（P＜0.05）,形成期鳃和闭壳肌组织的GSK3β相对表达量明显高于其它组织（P＜0.05）。本研究探讨了GS和GSK3β的组织时空表达规律及其与糖原含量变化的关系,为阐释GS和GSK3β对糖原代谢的调控相关研究提供了数据。4.GSK3β基因RNA干扰研究通过RNA干扰技术研究了近江牡蛎闭壳肌和肝胰腺中GSK3β基因对GS表达的调控作用。结果表明,在闭壳肌和肝胰腺组织中注射dsRNA后24h时,肝胰腺RNAi组的GSK3β的表达量显著低于对照组表达量（P＜0.05）,此时GS的表达量高于对照组,在闭壳肌组织中差异不显著;注射dsRNA后48 h时,两个组织中RNAi组GSK3β的表达量显著低于对照组表达量（P＜0.05）,此时肝胰腺组织中GS的表达量显著高于对照组,在闭壳肌组织中GS表达差异不显著（P＜0.05）;注射后72 h,两个组织中RNAi组的GSK3β表达量均极显著高于对照组（P＜0.01）,RNAi组的GS表达量显著高于对照组（P＜0.05）,说明GSK3β基因的沉默表达会导致GS基因表达的上调,且在肝胰腺组织中表现更快更显著。本研究初步探究了近江牡蛎GSK3β基因沉默后对GS基因表达的影响,为其调控关系的确定提供了研究基础。