红松对PC12细胞氧化损伤抑制物分离鉴定及AD小鼠生理功能研究

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阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种不可逆的神经退行性脑部疾病,具有记忆能力丢失和认知功能障碍等特点。AD发病机理复杂,但与氧化应激存在密切的联系。研究表明从天然产物中分离得到的植物化学物具有改善脑部氧化应激的作用,从而缓解阿尔茨海默病。本课题采用系统的分离提取技术,得到五种极性不同的组分,通过建立体外H2O2诱导的PC12细胞(大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤)氧化损伤模型,筛选出具有抑制氧化损伤的正丁醇萃取物(PKBE);PKBE用AB-8大孔树脂进一步分离,筛选出对氧化损伤抑制效果更佳的PKBE50%乙醇洗脱组分(PKBE-50);研究了PKBE-50对PC12细胞氧化损伤抑制途径,通过阿尔茨海默病动物模型,验证了PKBE-50的生理功能。主要研究内容包括:采用95%乙醇冷浸提取红松球果,残渣用水蒸气回流提取,浓缩后的乙醇浸膏用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇进行逐级萃取,对萃取物进行成分分析。结果表明正丁醇萃取物(PKBE)中多酚和黄酮含量较高,而水提物(PKWE)中多糖含量最高。通过H2O2诱导的PC12细胞氧化损伤模型,发现PKBE对氧化损伤抑制作用最强。利用AB-8大孔树脂对PKBE进行分离,用不同梯度乙醇洗脱,对洗脱物进行活性跟踪。结果表明PKBE-50能明显提高H2O2损伤后细胞的存活率、降低乳酸脱氢酶(LDH)渗漏,抑制脂质过氧化物的生成,提高H2O2损伤后细胞内SOD的活性;PKBE-50还能通过清除细胞内的活性氧,抑制PC12细胞氧化损伤后线粒体膜电位的下降,达到抑制PC12细胞氧化损伤的作用。采用高效液相-质谱联用技术对PKBE-50的组成进行分析,结果表明PKBE-50含有咖啡酸、穗花杉双黄酮、二氢杨梅素乙酰葡萄糖苷、锦葵花素3-O-葡萄糖苷等黄酮多酚类物质等组成。通过腹腔连续注射D-半乳糖和亚硝酸钠建立氧化应激AD模型,研究了PKBE-50对小鼠学习和记忆以及小鼠脑组织中抗氧化酶系的影响。发现AD模型小鼠灌胃给予PKBE-50,能够明显改善AD模型小鼠的学习和记忆能力,延长跳台实验潜伏期,减少错误次数,缩短小鼠找到水迷宫平台时间;PKBE-50能提升AD模型小鼠脑组织中SOD、GSH-Px抗氧化酶系的活性,降低脂质过氧化物MDA的含量,从而对AD模型小鼠具有一定的防护作用。综上,PKBE-50具有抑制氧化应激的作用。
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