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目的研究叶酸(folic acid,FA)对Aββ1-40诱导神经元AD细胞模型的影响,探讨叶酸基于DNA甲基化途径对神经元AD细胞模型作用的机制,确定叶酸-DNA甲基化-AD三者之间的关联,为叶酸在AD防治中的作用提供科学依据。方法采用无血清细胞培养法,培养新生大鼠海马神经元,并用Aβ1-40诱导神经元为AD细胞模型,其中用β-tubulin-Ⅲ免疫荧光鉴定,并将细胞分为5组:①正常细胞对照组(folic acid-free differentiation medium,10 μmol/L,Control);②叶酸缺乏 AD 组(folic acid deficiency,0μmol/L,Aβ+FA-D);③正常叶酸 AD 组(normal folic acid,10 μmol/L,Aβ+FA-N);④低叶酸 AD 组(low folic acid,20 μmol/L,Aβ+FA-L);⑤高叶酸 AD 组(high folic acid,40 μmol/L,Aβ+FA-H)。在神经元培养第8d加Aβ1-40和叶酸,作用48h后全量换液,再加叶酸继续作用48h后收集细胞。采用MTT法检测不同浓度叶酸作用下神经元AD细胞模型的活性;乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)测定试剂盒检测检测细胞培养液中LDH的活性;流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测细胞凋亡率;高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)检测细胞内S-腺苷甲硫氨酸(s-adenosylmethionine,SAM)、S-腺苷半胱氨酸(s-adenosylhomocysteine,SAH)的水平;采用甲基转移酶活性检测试剂盒检测DNMTs(DNAmethyltransferases,DNMTs)总活性;采用 DNA 甲基化定量试剂盒检测细胞总甲基化水平;RT-PCR(反转录PCR)检测APP、PS1、PS2和DNMTs基因的mRNA水平;Western Blot检测淀粉样前体蛋白(amyloid precusor protein,APP)、早老素 1(presenilinl,PSl)、早老素 2(presenilinl,PS2)和 DNMTs 基因的蛋白表达。结果采用无血清细胞培养法体外神经元培养7d后,神经元贴壁生长,胞体较大,细胞核明显,折光性强,突起增多并逐渐成网,经β-tubulin-Ⅲ免疫荧光染色鉴定为阳性。体外Aβ1-40诱导神经元为AD细胞模型并加叶酸干预后,形态学观察:与Aβ+FA-N组相比,Aβ+FA-D组神经元状态不佳,突起回缩;Aβ+FA-L组和Aβ+FA-H组神经元损伤程度明显减轻,细胞形态基本完整。MTT检测结果显示:与Aβ+FA-N组相比,Aβ+FA-D组细胞活性降低;Aβ+FA-L组和高叶酸AD组细胞活性升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。LDH活性检测结果显示:与Aβ+FA-N组相比,Aβ+FA-D组细胞LDH活性升高,细胞受损程度增大;Aβ+FA-L组和Aβ+FA-H组细胞LDH活性降低,细胞受损程度降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。FCM检测结果显示:与Aβ+FA-N组相比,Aβ+FA-D组细胞凋亡率升高;Aβ+FA-L组和Aβ+FA-H组细胞凋亡率降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。HPLC检测结果显示:与Aβ+FA-N组相比,Aβ+FA-D组SAH浓度升高,SAM/SAH比值降低;Aβ+FA-L组SAM浓度升高,SAM/SAH比值增大;Aβ+FA-H组SAM浓度升高,SAH浓度降低,SAM/SAH比值增大,差异均有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR检测DNMTs基因mRNA水平结果显示:与 Aβ+FA-N 组相比,Aβ+FA-D 组 DNMT1、DNMT3a 和 DNMT3b的mRNA水平均降低;Aβ+FA-L组DNMT3a和DNMT3b的mRNA水平均升高;Aβ+FA-H组DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的mRNA水平均升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。Western Blot检测DNMTs蛋白表达结果显示:与Aβ+FA-N组相比,Aβ+FA-D组DNMT3a和DNMT3b的蛋白表达降低;Aβ+FA-L组和Aβ+FA-H组DNMTβb的蛋白表达降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。DNMTs总活性检测结果显示:与Aβ+FA-N组相比,Aβ+FA-L组和Aβ+FA-H组DNMTs活性升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。DNA总甲基化水平检测结果显示:与Aβ+FA-N组相比,Aβ+FA-D组细胞总甲基化水平降低;Aβ+FA-L组和Aβ+FA-H组细胞总甲基化水平升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR检测AD相关基因mRNA水平结果显示:与Aβ+FA-N组相比,Aβ+FA-D组 APP、PS1 和 PS2 的 mRNA 水平均升高;Aβ+FA-L 组和 A(3+FA-H 组 APP、PS1和PS2的mRNA水平均降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。Western Blot检测AD相关基因蛋白表达结果显示:与Aβ+FA-N组相比,Aβ+FA-D组APP和PS 1的蛋白表达均增高;Aβ+FA-L组PS 1的蛋白表达降低;Aβ+FA-H组APP的蛋白表达降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论叶酸可降低AD相关基因的表达,对Aβ1-40诱导神经元损伤具有一定的保护作用。其可能的机制是:叶酸通过增加DNMT1,DNMT3a和DNMT3b基因的表达提高DNMTs总活性,通过改变甲基化途径中关键代谢物SAM和SAH浓度,促进甲基化反应的发生,从而提高细胞的总甲基化水平,提高神经元的活性。