论文部分内容阅读
类脂A是革兰氏阴性细菌细胞外膜外侧脂多糖的主要组成成分,也是内毒素的活性成分,可以被宿主免疫细胞识别并引发体内的病原反应。类脂A的合成途径相对保守,但在转运到外膜外侧的过程中它的结构会发生不同的修饰作用以适应不同的外界环境。类脂A的结构修饰在细菌体内受到的调控非常严谨且与细菌的致病性密切相关,却不影响细菌的生长繁殖。本课题立足于该领域的最新研究进展,以野生型大肠杆菌的类脂A分子为研究对象,以疫苗佐剂MPL为类脂A定向改造的最终目标,对大肠杆菌中类脂A分子结构的修饰进行了一定的研究,取得的主要成果如下：(1)分别构建了重组载体pWSK29-pagL和pWSK29-pagP,对PagL和PagP在大肠杆菌W3110中的表达及其对类脂A的修饰进行了初步的研究,结果发现虽然二者均为与类脂A脂肪酸链修饰相关的细胞外膜蛋白,但是在W3110中表达后它们对类脂A结构的修饰作用相差却很大：PagL表达后能催化绝大部分类脂A的脱酰基化,而PagP表达后对类脂A结构的修饰作用却非常有限,说明与PagL的修饰作用相比,大肠杆菌的pagP基因不但受到PhoP-PhoQ转录水平的调控,其表达产物PagP的活性也受到其他外界条件的影响。(2)构建了三个目的基因共表达的重组载体pWSK29-pagL-lpxE-pagP,实现了MPL的大肠杆菌体内合成,但是菌株中类脂A的成分比较复杂,含有四种经过修饰的类脂A结构,其中MPL的比例较小(3)建立了一种简单快速高效的用于外源基因在大肠杆菌染色体lacZ位点上整合表达的新方法,选用cat作为报告基因验证了该方法的可行性,结果表明大肠杆菌突变株W3110-cat具有氯霉素的抗性但对卡那霉素敏感,说明cat基因在染色体上可以正常表达并去除了用于筛选的抗性标记。该方法的建立为类脂A结构的定向改造提供了一种不依赖于载体的新途径。(4)利用上述染色体整合表达的方法构建了三种大肠杆菌突变株CW001、CW002和CW004:CW001的染色体上整合有来自弗朗西斯菌的lpxE基因,IPTG诱导的条件下几乎所有的类脂A都被单磷酸类脂A代替,为单磷酸类脂A衍生物的开发提供了良好的出发菌株；CW002的染色体上整合有来自沙门氏菌的pagL基因和来自弗朗西斯菌的lpxE基因,类脂A结构分析发现CW002中类脂A发生了相应的结构修饰；而CW004的染色体上整合有kan启动子控制的三个目的基因pagL、lpxE和pagP,类脂A结构鉴定结果显示该突变株能够合成MPL且其比例与载体表达时基本相同。