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机体通过活化交感神经系统和分泌儿茶酚胺肾上腺素与去甲肾上腺素来对抗环境中的有害刺激。这些荷尔蒙可以直接与细胞表面的G蛋白偶联肾上腺素能受体相结合,继而产生一系列应答反应,并对生物体产生更持久的影响。应激反应通常是瞬时的,它可以导致免疫抑制、生长抑制以及分解代谢的增强。流行病学的研究表明慢性应激反应则可导致DNA的损伤和各种疾病,例如衰老、肿瘤形成、流产和神经精神疾病、消化性溃疡、心血管紊乱等。肾上腺素和去甲肾上腺素可以促进细胞内氧化应激,氧化应激可以进一步导致促癌基因的活化、肿瘤抑制基因的失活、DNA损伤和基因组的不稳定性,例如,儿茶酚胺则可以通过羟基自由基的产生导致DNA的损伤。然而,应激产生的负面效应的机制尚不清楚。肾上腺素(epinephrine, EPI)是一种儿茶酚胺应激荷尔蒙,由肾上腺髓质分泌。肾上腺素的水平受到心理应激的调控,主要是通过调节其生物合成酶苯乙醇胺N-甲基转移酶(phenylethanolamine N-methyltransferase, PNMT)来实现的。早期生长反应基因-1(Early Growth Response protein-1, EGR-1)和特异蛋白1(specificity protein, Spl)是PNMT转录激活子,通过诱导肾上腺髓质中PNMT基因的表达对抗低氧应激。应激荷尔蒙可以调节很多重要的生理功能和疾病状态。此外,研究表明在心理应激条件下促进了肾上腺素的释放,因此本论文采用肾上腺素来构建细胞和小鼠的慢性应激模型。硫氧还蛋白-1(Thioredoxin-1, Trx-1)是一个小分子量的氧化还原调节蛋白,在维持细胞的氧化还原状态中起重要作用。氧化态的硫氧还蛋白包含一个二硫键,它可以被NADPH依赖的硫氧还蛋白还原酶所还原,进而起到抗氧化的功能。研究表明Trx-1可以清除氧和羟基自由基。Trx-1还可以保护细胞免受过氧化氢、紫外线的照射细胞损伤以及缺血再灌注引起的脑损伤。Trx-1转基因小鼠与野生型小鼠相比,其寿命延长30%,且Trx-1转基因小鼠可以抵抗糖尿病及环境因素引发的毒性。多种应激物均能诱导Trx-1的表达,包括病毒感染、X-射线、γ-射线、过氧化氢和炎症等。这些研究表明Trx-1在细胞损伤和对抗应激过程中具有保护效应,然而Trx-1是否参与了慢性肾上腺素应激及其分子机制尚不清楚。本论文的主要目的是探索Trx-1和慢性肾上腺素应激之间的相互关系以及Trx-1调节肾上腺素应激的分子机制。本论文的主要研究结果如下：(1)肾上腺素诱导DNA损伤的累积。用0,1,5和10μM的肾上腺素刺激PC12细胞24 h或每天给小鼠灌注0.2 mg/kg的肾上腺素2周后,Western Blot方法检测γ-H2AX(DNA损伤的早期标志)的表达变化；用10μM的肾上腺素刺激PC12细胞24 h,免疫荧光方法观察细胞内γ-H2AX的表达。结果显示肾上腺素显著增加了γ-H2AX的表达水平,并在荧光显微镜下观察到γ-H2AX荧光点的形成,表明慢性肾上腺素的处理可以引起DNA损伤。用p-肾上腺素能受体抑制剂propranolol、腺苷酸环化酶抑制剂SQ22536和蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)的抑制剂H-89预刺激PC12细胞30 min,再用肾上腺素刺激24 h,结果显示肾上腺素引起的γ-H2AX表达的增加分别被propranolo、SQ22536和H-89所抑制,表明肾上腺素引起的DNA损伤通过p-肾上腺素能受体/cAMP/PKA信号通路。本论文还检测了肾上腺素对DNA损伤修复分子表达的影响。结果显示慢性肾上腺素处理后引起p53和C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein, CHOP)表达的下降,表明慢性肾上腺素的处理可以导致DNA损伤修复分子表达的下降,进而导致了DNA损伤的累积。(2)Trx-1参与肾上腺素应激。Trx-1可以被多种应激诱导,但是Trx-1是否参与了肾上腺素应激尚未报道。用0,1,5和10 μM的肾上腺素刺激PC12细胞24 h或每天给小鼠灌注0.2 mg/kg的肾上腺素2周后,Western Blot方法检测Trx-1的表达变化,结果显示慢性肾上腺素刺激可以显著增加Trx-1的表达。本论文进一步检测了肾上腺素诱导Trx-1表达的信号通路,分别用propranolol,SQ22536和H-89预刺激PC12细胞30 min,再用肾上腺素刺激24 h。结果显示肾上腺素诱导Trx-1表达可以被propranolol、SQ22536和H89抑制,表明肾上腺素通过β-肾上腺素能受体/cAMP/PKA信号通路诱导Trx-1表达。(3)Trx-1对肾上腺素应激的调节作用。为了阐明Trx-1是否在慢性肾上腺素应激中起重要作用,将PC12细胞中Trx-1高表达或低表达,Western Blot方法检测γ-H2AX和p53的表达变化。结果显示Trx-1表达下调加剧了肾上腺素引起的的γ-H2AX表达的增加及p53水平的降低,表明Trx-1低表达加重了肾上腺素诱导的DNA损伤的累积。相反,Trx-1高表达抑制了肾上腺素诱导的γ-H2AX增加并回复了p53水平的下降,表明高表达Trx-1抑制了肾上腺素诱导的DNA损伤的累积。本论文进一步在小鼠水平上,研究Trx-1高表达对肾上腺素应激的影响。野生型肾上腺素组小鼠和人Trx-1转基因肾上腺素组小鼠每天灌注0.2 mg/kg的肾上腺素2周,对照组野生型小鼠和人Trx-1转基因小鼠则给予等体积生理盐水。Western Blot方法检测海马、皮层和胸腺(主要应对应激的器官)中γ-H2AX、p53、 CHOP和细胞周期素Cyclin D1的表达变化；ELISA方法检测丙二醛(malondialdehyde, MDA)(氧化应激的标志)含量的变化。与细胞结果一致的是,转基因小鼠高表达Trx-1抑制了肾上腺素诱导的γ-H2AX增加并回复了p53和CHOP的降低。此外,转基因小鼠高表达Trx-1还抑制了肾上腺素诱导的Cyclin D1增加和MDA含量的增加,表明Trx-1在慢性肾上腺素应激中起保护作用,这一作用可能与其抗氧化作用密切相关。(4)Trx-1对β-arrestin-1的调节作用。本论文进一步研究了Trx-1调节慢性肾上腺素应激的分子机制。除了氧化应激能够引起DNA损伤以外,β-arrestin-1也是调节DNA损伤的一个关键分子,因此本论文研究了肾上腺素对β-arrestin-1表达的影响。结果显示肾上腺素通过p-肾上腺素能受体/cAMP/PKA信号通路诱导β-arrestin-1的表达,并进一步检测了β-arrestin-1对肾上腺素引起DNA损伤的影响。结果显示下调β-arrestin-1的表达抑制了肾上腺素诱导的γ-H2AX和cyclinD1的表达、PC12细胞活力的增加、并回复了p53水平的下降,表明β-arrestin-1低表达抑制了肾上腺素应激诱导的DNA损伤,及细胞内对DNA损伤的应答,因此β-arrestin-1是肾上腺素诱导DNA损伤累积的一个关键蛋白。Trx-1和β-arrestin-1都参与了肾上腺素应激过程,因此本论文探讨了Trx-1和β-arrestin-1之间的相互关系,将Trx-1高表达或低表达后,Western Blot方法检测β-arrestin-1的表达变化,结果显示Trx-1可以负调节β-arrestin-1的表达。鉴于此,本论文研究了Trx-1与β-arrestin-1是否能够相互结合。首先检测了Trx-1与β-arrestin-1在细胞核与细胞质中的相对分布,Western Blot结果显示,Trx-1和β-arrestin-1在细胞核中的表达均增加。免疫共沉淀结果显示,在PC12细胞中,Trx-1与β-arrestin-1具有内源性的相互结合,且在肾上腺素作用后,Trx-1与β-arrestin-1之间的相互作用增强,表明Trx-1通过与β-arrestin-1相互结合进而负调控β-arrestin-1的表达。本论文系统地在体内和体外研究了Trx-1和慢性肾上腺素应激之间的相互关系以及Trx-1调节肾上腺素应激的分子机制。从实验结果得出结论：肾上腺素通过p-肾上腺素能受体/cAMP/PKA信号通路诱导Trx-1和β-arrestin-1表达,在肾上腺素应激过程中Trx-1通过调节β-arrestin-1的表达,抑制了肾上腺素引起的DNA损伤,从而发挥保护作用。