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前言胃癌是人类最常见且预后较差的恶性肿瘤之一,幽门螺杆菌感染是胃癌发病的重要诱发因素。最近研究发现,吸烟者比从不吸烟者具有更高的胃癌风险,和烟草中的尼古丁具有强烈的致癌成份有关。尼古丁能促进胃癌细胞体内外生长增殖和血管新生,激活胃癌细胞中的环氧合酶-2(COX-2)和血管内皮生长因子(VEGF)受体,导致肿瘤的侵袭和转移。Periostin又称为成骨细胞特异性因子-2(OSF-2),是一种新发现的粘附分子,是间质细胞特异性蛋白,在肿瘤间质细胞表达并分泌,有研究表明其在多种肿瘤中表达异常增高,可能与肿瘤侵袭、远处转移和血管新生相关。虽然尼古丁对肿瘤细胞侵袭和上皮一间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的促进作用得到越来越多的研究支持,但关于尼古丁和EMT的标记分子periostin的关系还没有相应报道。我们研究了尼古丁体外处理胃癌细胞后periostin的表达改变,并应用RNA干扰技术沉默periostin基因后,研究尼古丁对胃癌细胞的生长、凋亡和侵袭的影响。Periostin在多种肿瘤中表达升高,并且认为可能和肿瘤侵袭、转移和预后相关,但目前还没有关于periostin在胃癌中的系统性研究。因此我们选择了74例胃癌患者的手术切除标本和血清,应用免疫组织化学和酶联免疫吸附法检测了periostin和COX-2蛋白的表达,并与健康人群的相应标本进行了对照。我们的研究期望获得一种新的胃癌血清标记物,在提示胃癌的临床病理特征方面具有重要意义。目的1.探索periostin基因沉默后对胃癌细胞增殖、凋亡、侵袭的影响；2.研究胃癌患者的胃癌组织和血清中periostin蛋白的表达及其与临床病理因素的相关性。方法1)通过细菌转化、酶切、凝胶电泳、基因测序鉴定和基因重组技术等方法构建针对periostin的siRNA质粒pRNAT-U6.1-periostin和阴性对照质粒pRNAT-U6.1-CON。利用脂质体介导转染技术转染人胃癌SGC-7901细胞,经G418筛选得到稳定抑制periostin表达的胃癌细胞模型(siRNA-periostin细胞)；2)采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测siRNA-periostin细胞中periostin mRNA的表达。通过MTT比色法检测periostin基因沉默对胃癌细胞体外增殖能力的影响。PI染色固定的方法检测periostin基因沉默对胃癌细胞周期分布的改变。AnnexinⅤ和PI双染并经流式细胞仪检测转染细胞对化学药物氟尿嘧啶(5-FU)的敏感性。采用Boyden小室侵袭实验检验periostin基因沉默对胃癌细胞侵袭性的影响。3)利用免疫组织化学技术检测74例胃癌组织及35例非肿瘤胃黏膜中periostin蛋白和COX-2的表达,分析其与临床病理学参数的关系。应用酶联免疫吸附实验检测胃癌患者手术前后及健康志愿者血清periostin蛋白的COX-2的表达水平,并分析与临床病理学参数的关系。结果1)用免疫印迹检测了尼古丁处理后胃癌SGC-7901细胞,periostin蛋白表达显著升高；COX-2特异性抑制剂NS398预处理后的胃癌SGC-7901细胞,尼古丁对periostin蛋白的上调作用几乎被完全阻断,同时单纯抑制COX-2也能使periostin蛋白的表达下调。2)应用小干扰RNA技术(siRNA),在胃癌细胞SGC7901中特异性沉默periostin基因的mRNA表达后,尼古丁处理的胃癌细胞的增殖速度显著降低；对化学药物氟尿嘧啶(5-FU)的凋亡敏感性增强,特别是在48h和72h时的增敏作用更显著；同时,无论是对于未处理细胞,还是尼古丁处理细胞,EMT标志基因Snail蛋白的表达均显著降低。3)免疫组织化学技术检测,periostin和COX-2,在胃癌组织中的表达强度均显著高于非胃癌对照；酶联免疫吸附实验,发现无论periostin还是COX-2,在胃癌患者血清中的浓度均显著高于健康人群的血清浓度。4)通过临床病理分析,periostin和COX-2的表达与有无淋巴结转移、肿瘤浸润深度有关,与肿瘤分化程度与性别无关。同时发现periostin蛋白表达在血清和胃癌组织之间缺乏显著相关性,但血清和胃癌组织中periostin和COX-2蛋白表达具有显著相关性,手术后胃癌患者血清periostin和COX-2均显著降低证实了相关联系。结论1) periostin是尼古丁在胃癌细胞中的一个调控靶基因,其受尼古丁上调表达是COX-2依赖性的。2) siRNA沉默periostin基因表达能抑制胃癌细胞的生长增殖、侵袭和转移,促进胃癌细胞对化学药物凋亡的敏感性。3)胃癌患者periostin蛋白血清浓度和胃癌组织表达显著高于健康人群。在胃癌患者中,具有淋巴结转移和肿瘤浸润较深的患者,其血清和胃粘膜periostin蛋白更高。胃癌患者periostin蛋白在行胃癌手术切除后显著下降。4)胃癌患者血清periostin蛋白浓度和COX-2蛋白浓度呈正相关,这种相关性也存在于胃粘膜组织中periostin蛋白和COX-2蛋白之间。5)本研究提示periostin蛋白可作为预示胃癌细胞侵袭和转移的个血清标记物,对于预测患者胃癌进展和预后具有重要意义。