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胰高血糖素由胰岛α细胞所分泌,是由29个氨基酸组成的单链多肽。胰高血糖素在新陈代谢中和胰岛素起协调拮抗作用,参与糖、蛋白质和脂肪代谢的调节作用,其作用恰与胰岛素作用相反。能够使血糖升高,促进蛋白质分解,使蛋白质合成减少,促进脂肪分解,抑制脂肪酸的合成。胰高血糖素已经作为药物上市,在临床上,主要用于治疗由胰岛素治疗糖尿病病人引发的严重低血糖反应和新生儿低血糖,也可用于放射性检查过程中暂时抑制肠胃的运动。研究表明多肽激素的C端酰胺化是重要的转录后加工过程,很多多肽激素的酰胺化末端为其完全生物活性所必需,某些多肽酰胺化与否其活性甚至相差10000倍,多肽酰胺化后可能会延长蛋白的半衰期,增加与受体的亲合力。天然胰高血糖素并非以酰胺化的形式存在,但是对其结构与功能的研究发现在对其C端进行酰胺化改造后,能够显著提高其与受体的亲合力,所以我们尝试通过基因工程手段获得酰胺化的胰高血糖素。本研究通过PCR扩增获得了C端加有甘氨酸（Gly）的胰高血糖素基因。将该基因置换链霉菌质粒pMSA中原有sCT基因,构建得到重组质粒pMGA,将重组质粒转化S.lividans TK24,获得可表达胰高血糖素衍生物的基因工程菌。上述表达产物经纯化后,获得了HPLC分析纯度为93.4%的胰高血糖素衍生物。对N端14个氨基酸序列进行测定,结果表明重组胰高血糖素衍生物N端14个氨基酸序列和天然胰高血糖素完全一致;采用飞行质谱（MALDI TOF）测定该蛋白分子量为3494,和预计的酰胺化胰高血糖素分子量基本一致,因此确证本研究获得了可以直接产生酰胺化胰高血糖素的基因工程菌S.lividans[pMGA]。采用PCR扩增获得胰高血糖素-Gly衍生物的基因。以pET-30a为载体构建重组质粒pET-G,转化至E.coliBl21菌株,得到重组菌株Bl21[pET-G],经SDS-Tricine-PAGE、western blot和ELISA分析确定该工程菌表达了分子量为9.5kD具有生物活性的融合蛋白,对融合蛋白进行了镍离子亲合柱层析纯化,并对该蛋白进行凝血酶酶切,经HPLC纯化得到纯度为88.3%的产物。飞行质谱测定分子量为3531,与预期重组胰高血糖素-甘氨酸的分子量基本相符,结果显示获得了重组胰高血糖素-甘氨酸衍生物。以含α-酰胺化酶基因的质粒pMSA为模板,经PCR扩增获得该酶编码基因,以pET-30a为载体,获重组质粒pET-A转化E.coli Bl21得到重组菌株E.coliBl21[pET-A]。经SDS-PAGE、western blot分析,表达蛋白分子量80kD与预期值基本相符,经亲合层析对蛋白进行纯化,HPLC分析其纯度为86.6%,该蛋白能作用于三肽Tyr-Val-Gly,使其C端酰胺化成为酰胺化二肽Tyr-Val-NH2,因此可以确证该重组蛋白为α-酰胺化酶。本研究首次在链霉菌中分泌表达了酰胺化胰高血糖素,并分别在大肠杆菌中表达了胰高血糖素-甘氨酸和α-酰胺化酶,从而为经体外酰胺化途径获得酰胺化胰高血糖素创造了有利条件。在体内酰胺化胰高血糖素可能较天然非酰胺化胰高血糖素半衰期长,因此具有潜在应用前景。本研究也可能为其他活性肽的酰胺化研究提供基础。