脊髓损伤(Spinal cord injury,SCI)后运动功能损害与康复是当今广大神经科学研究者亟待解决的重大课题之一。脊髓是躯体和四肢反射活动的低级中枢,它通过接受神经通路的上行、下行信息并予以整合、编码,以及神经元之间的突触、纤维联系及神经递质的相互作用而完成运动和姿势的维持。因此,脊髓损伤所致截瘫与运动神经元对传入、传出信息的加工、处理、编码及整合作用异常直接相关。虽然目前有诸如手术、细胞移植和电子工程等策略来帮助脊髓损伤截瘫患者恢复运动功能,但总体而言其疗效甚微。这可能与目前我们对运动神经元在脊髓损伤后,信息编码的变化规律及其反馈调控机制改变缺乏了解有关。研究表明,脊髓损伤后的病理改变特征是“急性、进行性、中央型变性坏死”,这提示脊髓损伤后灰质的损伤早于白质。而灰质是神经元所在区域,那么不同类型神经元对损伤因素的反应是否具有差异,目前尚不十分清楚。神经元根据功能可分为感觉神经元、中间神经元和运动神经元,其中运动神经元和中间神经元与脊髓运动功能直接关联。脊髓作为初级运动中枢,在接受了高级中枢发出的运动指令后,运动神经元会产生动作电位,将运动指令以电信息编码的方式传递给下行通路,同时在该过程中释放神经递质,传递化学信息。为保证运动指令执行的准确和适度性,运动神经元的活动要受到中间神经元的调控,其中脊髓运动神经元特异性地接受一种特殊类型中间神经元闰绍细胞(Renshaw cell,RC)的抑制性输入,形成回返抑制通路。当运动神经元兴奋时,传出冲动沿其轴突外传,同时又经轴突侧支兴奋闰绍细胞,闰绍细胞则反过来抑制运动神经元,从而使运动神经元不会无限制地兴奋。如果闰绍细胞和运动神经元对损伤因素易感性有差异,那么闰绍细胞和运动神经元的电活动会发生什么样的改变,尤其当闰绍细胞功能受损时是否会影响其对运动神经元的抑制作用,使运动神经元处于“去抑制”状态,从而造成运动神经元放电特征及其整合功能的改变,目前尚不清楚。既往关于脊髓神经元电活动的研究,主要是通过在体实验和膜片钳技术研究在生理条件下神经元的电活动,仅有少部分研究者观察了脊髓损伤模型中神经元电活动。有研究者观察了光化学致脊髓短暂性缺血时(几分钟)或半切损伤时背角神经元的电活动的改变,以及大鼠尾部缺血再灌注对脊髓背角会聚性神经元高兴奋性及机械超敏感性的影响,这些研究均未反应脊髓损伤过程中,不同种类神经元电活动的变化及其相互作用关系。因此,利用动物脊髓损伤模型在体动态记录闰绍细胞和运动神经元在损伤过程中电活动的变化,以及运动神经元整合功能的改变,明确闰绍细胞和运动神经元在损伤条件下的差异性表现,对进一步认识脊髓损伤后机体功能障碍的电生理机制具有重要意义。神经递质在中枢神经系统损伤中发挥着重要作用,回返抑制通路中闰绍细胞是释放抑制性递质甘氨酸(glycin,Gly)超级化运动神经元,抑制运动神经元兴奋的发放。在既往的兴奋毒性学说主要关注的是谷氨酸及其受体,而对于抑制性递质的关注相对较少。近年来关于抑制性递质γ-氨基丁酸(aminobutyric acid,GABA)的在中枢神经系统损伤中的作用也存在争议;Gly及其受体的作用既往研究主要集中在脊髓病理性疼痛模型中,而在脊髓损伤过程中作为闰绍细胞和运动神经元间的特异性抑制递质,Gly及其受体如何变化,是否与其他递质一起参与了神经元兴奋毒性损伤,最终导致神经元进入钙超载这个公共死亡通路,目前仍不十分清楚。脊髓缺血再灌注损伤模型,由于在造模过程中保持了脊髓组织结构的完整性,有利于在体记录神经元损伤过程中电生理活动的变化,为此,本课题研究首先建立经典的家兔脊髓缺血再灌注模型,利用神经病理、免疫组化和神经电生理学及分子生物学等技术方法,观察脊髓缺血及再灌注过程中神经元形态和电生理活动的变化,并进一步探讨相应神经递质及其受体和胞内钙离子的变化规律,以揭示脊髓缺血再灌注损伤过程中运动神经元和中间神经元的损伤特点及其致瘫的神经生物学机制。主要技术方法:1.构建腰动脉和腹主动脉阻断法两种经典的脊髓缺血再灌注损伤模型,通过神经行为学检测筛选出适合本实验的损伤模型。2.在筛选模型基础上利用神经功能评估技术,在缺血30min、60min和90min条件下不同再灌注时间的家兔截瘫发生情况进行比较分析,确定适合后续实验研究的缺血再灌注损伤时间。3.通过HE、Nissl染色观察缺血再灌注损伤脊髓不同部位组织结构的病理损伤特点;进一步通过免疫荧光染色观察不同种类神经元的损伤情况。4.利用单位放电记录技术,在体记录脊髓运动神经元和中间神经元在正常、缺血和再灌注过程中放电活动的动态变化,并通过Neuro Explorer5.0软件对神经元放电活动的变化规律进行时频分析。5.利用ELISA和Western-blot方法,检测脊髓缺血再灌注过程中神经递质及其受体蛋白的变化,并通过实时免疫荧光定量检测该过程中神经元胞内钙离子浓度以及相关钙蛋白的改变。主要结果:1.通过比较家兔腰动脉和腹主动脉阻断法建立的脊髓缺血再灌注损伤模型,提示腹主动脉阻断模型具有致瘫率高、易操作和重复性好的特点,更适合本实验研究。2.在家兔腹主动脉阻断模型中,缺血30min、60min和90min能分别复制出脊髓轻度、中重度和极重度损伤;截瘫严重程度与脊髓缺血时间密切相关:缺血少于30min,再灌注损伤可逆;大于30min时随着再灌注时间延长脊髓功能损害逐渐加重、损伤不可逆,缺血90min损伤最严重、死亡率高。其中缺血60min致瘫率高、死亡率低,是研究脊髓缺血再灌注致瘫的理想时间。3.家兔脊髓缺血再灌注损伤后,后肢多表现为肌张力增高、牵张反射亢进、呈强直状态,为痉挛性瘫痪。4.缺血再灌注导致的脊髓损伤,灰质病理损害较白质明显;神经元尼氏小体崩解、核固缩、细胞形态消失以至死亡。脊髓运动神经元和中间神经元死亡率较接近,但中间神经元死亡数量相对更多。5.缺血和再灌注过程中,脊髓神经元早期主要表现为放电活动加强、后期放电逐渐减少;对内脏大神经和腓神经电刺激及同时刺激均出现兴奋、抑制和无反应三种改变,但对同时刺激无反应的神经元明显增加。运动神经元早期的放电常表现为震荡式的波动性增加,而中间神经元(闰绍细胞)则为持续高频爆发式发放,闰绍细胞对运动神经元放电有较明显的抑制作用。信息编码分析观察到:放电频率增加的神经元还表现出ISI明显缩短且分布更集中、更规则。6.脊髓缺血再灌注损伤后,CSEP和MEP的N1波峰潜时延长,波幅降低。7.缺血再灌注损伤过程中,EAA/IAA比例失调:其中兴奋性神经递质Glu升高,其与钙离子活动相关受体NR1表达也随之升高;抑制性递质Gly和GABA降低,相应受体的表达代偿性增加。Gly降低于再灌注后10min即可出现,而GABA的降低则主要发生在再灌注损伤72h后。8.神经元胞体内钙离子浓度在损伤后显著增高,胞内钙蛋白酶CalpainⅠ表达也相应增高,同时观察到CalpainⅠ特异性降解底物68-KDNFP浓度降低。主要结论:1.腹主动脉阻断法所致脊髓缺血再灌注损伤“窗口期”为缺血30min,所导致的后肢功能障碍主要表现为痉挛性瘫痪。2.脊髓组织细胞对缺血再灌注损伤存在较明显的易感性差异,其中灰质损伤更严重、中间神经元的死亡数目较运动神经元多,可能是脊髓缺血再灌注损伤致痉挛性瘫痪的病理学基础。3.脊髓缺血损伤早期神经元兴奋性增加、随着缺血时间延长其兴奋性逐渐降低,整合功能失调。中间神经元(闰绍细胞)对缺血再灌注损伤更为敏感,最终使运动神经元处于“去抑制”状态,由此导致的运动神经元高兴奋性反应,是造成脊髓缺血再灌注损伤致痉挛性瘫痪的重要电生理学机制。4.脊髓缺血再灌注损伤后,Glu释放增加、GABA和Gly释放减少,是造成神经元兴奋毒性损伤的重要原因,其中Gly及其受体主要在损伤早期而GABA在损伤中后期发挥作用,在此基础上引起的神经元钙离子内流增加、激活钙蛋白酶CalpainⅠ,使细胞骨架蛋白68-KDNFP降解,可能是导致神经元损伤、死亡的重要分子机制。