基于外泌体microRNA表达研究针刺治疗膝骨性关节炎的机制

来源 :成都中医药大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:juese1234567
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目的:通过对比膝骨性关节炎(Knee Osteoarthritis,KOA)患者针刺治疗前后血清外泌体micro RNA表达的变化,筛选与针刺效应相关的关键micro RNA。比较文献报道的micro RNA与本次研究发现的micro RNA的差异,并根据筛选到的关键micro RNA进行体外实验,研究其对软骨细胞增殖与凋亡的影响,以期探索针刺治疗KOA的潜在调节机制。方法:1.利用文献计量可视化软件Citespace与VOSviewer对KOA micro RNA相关研究进行文献挖掘,筛选目前研究中的热点micro RNA及主要靶点;2.共纳入KOA患者40例和健康受试者17例,将KOA患者随机分为针刺治疗组与等待治疗组。针刺治疗组选择鹤顶、内膝眼、犊鼻、血海、梁丘、阴陵泉、阳陵泉、足三里进行针刺治疗,每周3次,隔天治疗1次,周末休息2天,连续治疗4周,共12次。等待治疗组在针刺干预同时期不进行干预,待4周后再给予患者针刺治疗。所有KOA患者分别于入组0周和入组4周采用西部安大略麦克马斯特大学骨关节炎指数可视化量表(Western Ontario and Mc Master Universities Osteoarthritis index,WOMAC评分)、SF-12生活质量量表对针刺疗效进行评定。3.各组中分别选取15例进行micro RNA研究,其中10例进行高通量测序,5例用于后期RT-PCR验证实验。KOA患者血样分别在入组0周、4周后进行采集;健康受试者血样于入组0周时采集。收集血清后,超速离心法离心,分离血清外泌体,透射电镜下观察所分离的外泌体形态;Western Blot检测外泌体表面标志蛋白CD9、CD63、CD81表达情况;纳米颗粒跟踪分析(Nanoparticle Tracking Analysis,NTA)技术对外泌体进行粒径分析,以鉴定外泌体。采用small RNA测序技术对分离的外泌体中的micro RNA进行高通量测序。根据P<0.05,差异倍数、表达丰度高的原则,筛选差异表达micro RNA。通过将KOA患者与健康受试者血清外泌体micro RNA的差异表达谱、针刺组治疗前后的血清外泌体micro RNA的差异表达谱、等待治疗组4周前后血清外泌体micro RNA的差异表达谱作韦恩图,筛选出针刺治疗KOA的关键micro RNA。对所筛选出的micro RNA进行RT-PCR检测,以验证测序的准确性。并通过Target Scan和mi RDB对所筛选的针刺治疗KOA的关键micro RNA进行靶基因预测;用GO与KEGG分析进一步明确靶基因相关功能与信号通路。4.基于文献研究、高通量测序及RT-PCR验证的结果,选择软骨细胞作为后续研究的目的细胞,提取并培养乳鼠软骨细胞,通过免疫组化、免疫荧光及甲苯胺蓝染色对其进行细胞鉴定后,分别用所筛选到的micro RNA 338-3p inhibitor、micro RNA 15b-3p mimic对软骨细胞进行转染,用脂多糖刺激软骨细胞模拟细胞炎症,利用CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果:1.KOA micro RNA研究文献挖掘结果:共检索到850篇文章,涉及骨关节炎mi RNA的研究从2007年开始出现,总体呈递增趋势;该领域内研究的热点micro RNA有:mi R-140、mi R-146、mi R-26、mi R-34、mi R-27、mi R-181、mi R-193、mi R-30、mi R-233、mi R-206。这些mi RNA的主要作用靶点在于软骨细胞的增殖与凋亡。2.针刺治疗KOA患者的疗效结果:针刺组四周治疗后,WOMAC总分、WOMAC疼痛评分有所降低,差异有统计学意义(P<0.05);WOMAC僵硬评分、WOMAC功能评分、SF-12 PCS、SF-12 MCS改变不明显,差异无统计学意义(P>0.05)。等待治疗组四周后,WOMAC总分、WOMAC疼痛评分、WOMAC僵硬评分、WOMAC功能评分、SF-12 PCS、SF-12 MCS评分差异无统计学意义(P>0.05)。3.血清外泌体micro RNA表达的研究结果:KOA患者与健康受试者相比,共有207个差异表达的血清外泌体micro RNA,其中上调104个,下调103个;其中,hsa-mi R-490-3p与WOMAC疼痛评分呈负相关;hsa-mi R-1255b与WOMAC疼痛评分呈正相关。针刺组治疗前后相比,共有65个差异表达的外泌体micro RNA,其中上调32个;下调33个。等待治疗组经四周观察期后与基线比较,共有76个差异表达的micro RNA,其中上调43个;下调33个。4.针刺治疗KOA下调的mi RNA为:hsa-mi R-504-3p、hsa-mi R-1915-3p、hsa-mi R-103a-2-5p、hsa-mi R-887-3p、hsa-mi R-1228-5p、hsa-mi R-34c-3p、hsa-mi R-3168、hsa-mi R-518e-3p、hsa-mi R-1296-5p、hsa-mi R-338-3p、hsa-mi R-199b-5p;针刺治疗KOA上调的mi RNA为:hsa-mi R-514a-3p、hsa-mi R-4440、hsa-let-7f-5p、hsa-mi R-15b-3p。其中mi R-338-3p、mi R-15b-3p为文献中报道的mi RNA。5.RT-PCR验证结果:hsa-338-3p在KOA患者中的表达升高(P=0.332),经过等待观察期后无明显变化(P=0.647),针刺治疗后降低(P=0.149),但差异无统计学意义(P>0.05)。hsa-199b-5p在KOA患者中的表达升高(P=0.305),经过等待观察期后无明显变化(P=0.536),针刺治疗后仍表现出升高(P=0.252),差异均不具有统计学意义(P>0.05)。has-mi R-15b-3p在KOA患者中的表达升高(P=0.003),差异有统计学意义;分别经过等待观察期及针刺后均略有降低(P=0.083,P=0.661,),但差异不具有统计学意义(P>0.05)。hsa-mi R-1296-5p在KOA患者中的表达升高(P<0.001),差异有统计学意义;在分别经过等待观察期及针刺后均有降低(P=0.024,P=0.015),差异有统计学意义。hsa-mi R-3168在KOA病人与健康受试者中无明显差异(P=0.923),经过等待观察期及针刺后略有上升(P=0.1736,P=0.881,),差异均无统计学意义。6.生物信息学结果:对mi R-338-3p、mi R-15b-3p、mi R-199b-5p、mi R-1296-5p靶基因预测显示,mi RDB与Targetscan预测的交集共有262个靶基因。对262个预测靶基因进行KEGG pathyway富集分析共37条通路,主要涉及细胞凋亡、B细胞受体、胆碱能突触、多巴胺能神经突触、癌症等生化代谢途径,以及MAPK、TNF、m TOR、PI3K-Akt、Wnt、B细胞受体、HIF-1、AMPK、Erb B等通路;GO富集分析,主要参与调节RNA代谢过程、DNA模板化、核酸酶复合代谢、核酸模板转录、RNA生物合成过程等。7.mi R-338-3p inhibitor转染后软骨细胞增殖明显增加,差异有统计学意义(P<0.001);mi R-338-3p inhibitor转染后软骨细胞凋亡率略有降低,差异无统计学意义(P>0.05)。mi R-15b-3p mimic转染后软骨细胞增殖力略微上升,差异无统计学意义(P<0.001);mi R-15b-3p mimic转染后软骨细胞凋亡率降低,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:1.通过对KOA mi RNA的文献研究发现,该领域以软骨细胞为核心,主要涉及细胞增殖、凋亡及软骨形成等机制。2.临床研究显示KOA患者经针刺治疗后可有效缓解KOA患者关节疼痛;3.KOA患者与健康人血清外泌体测序发现,KOA患者与健康人血清外泌体mi RNA表达谱存在差异,其中上调表达的104个,下调表达的103个。针刺治疗可调节KOA患者血清外泌体mi RNA表达,其中mi R-338-3p、mi R-15b-3p、mi R-199b-5p、mi R-3168、mi R-1296-5p可能是针刺治疗KOA作用的关键mi RNA;进一步的生物信息学分析初步发现,针刺可能通过影响MAPK通路及细胞凋亡等途径发挥治疗作用。4.通过体外细胞学实验验证发现,mi R-338-3p可促进软骨细胞增殖,mi R-15b-3p可抑制软骨细胞凋亡,提示这可能是针刺治疗KOA的机制之一。
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