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第一部分2型糖尿病对于大鼠骨折愈合影响的研究目的:通过给予SD大鼠高脂饲料喂养,并腹腔注射低剂量链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)来建立2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)动物模型,并在此基础上建立右侧股骨干闭合性骨折动物模型,以此模型为基础对其骨折后第2、3周时骨折端愈合情况进行分析,研究T2DM对于骨折愈合的影响。方法:1.32只健康雌性(Sprague-Dawley,SD)大鼠,2月龄,所有实验大鼠被随机分为2组(n=16):骨折对照组(control fracture,CF),2型糖尿病骨折组(T2DM+fracture,DF)。2.大鼠在骨折第2、3周行X线检查后被处死并取材。检测其血清内各生化指标;利用番红O-固绿染色,分析骨痂内骨性、软骨性和纤维性骨痂所占骨痂总面积的比值;对骨痂内VEGF和α-SMA进行免疫组织化学染色,依次分析骨痂内VEGF的表达强度和血管密度。结果:1.T2DM模型建立后,实验过程中DF组血糖值显著高于CF组,T-CHO和TG浓度于骨折后第2、3周均显著高于CF组(P<0.05)。2.骨折后的第2、3周,DF组大鼠骨折愈合X线评分均显著低于CF组(P<0.05)。3.分析番红O-固绿染色结果显示,在骨折后第2周时,DF组骨性和软骨性骨痂的面积比均显著低于CF组(P<0.05),但其纤维性骨痂的面积比却显著高于CF组(P<0.05)。在骨折后第3周时,DF组骨性骨痂的面积比仍显著低于CF组(P<0.05),其纤维性骨痂的面积比仍显著高于CF组(P<0.05),但两组间软骨性骨痂的面积比无显著差异。4.骨折后第2周时,DF组骨痂中VEGF的表达量和血管密度均显著低于CF组(P<0.05),第3周时,CF组和DF组骨痂中VEGF的表达量无明显差异。DF组骨痂中的血管密度显著高于CF组(P<0.05)。第二部分双侧卵巢切除对2型糖尿病大鼠骨折愈合影响的研究目的:在建立T2DM动物模型的同时,切除大鼠双侧卵巢致其骨质疏松,并在此基础上建立右股骨干闭合性骨折模型,以研究此动物模型对于骨折愈合的影响。方法:1.48只健康雌性SD大鼠,2月龄,实验大鼠被随机分为3组(n=16):骨折对照组(control fracture,CF),2型糖尿病骨折组(T2DM+fracture,DF)、2型糖尿病并骨质疏松骨折组(T2DM+Osteoporosis Fracture,DOF)。2大鼠在骨折第2、3周行X线检查后被处死并取材。标本行Micro-CT检测后,骨组织彻底脱钙,利用马松(Masson)染色分析骨痂内骨性和软骨性骨痂所占骨痂总面积的比值;利用免疫组织化学染色方法,分析骨痂中ColⅡ和Caspase-3的表达情况。结果:1 T2DM模型成功建立后,DF组、DOF组大鼠血糖均明显高于CF组。2通过X线片测量骨痂面积结果显示,骨折后第2周时,DF组和DOF组的骨痂面积均显著小于CF组(P<0.05),DOF组显著小于DF组(P<0.05);骨折后3周时,CF组、DF组和DOF组之间无显著差异。3 Micro-CT检测显示,在骨折后第2周时,DOF组Tb.N显著低于CF组和DF组(P<0.05),CF组和DF组之间无显著差异;DF组和DOF组Tb.Th均显著低于CF组(P<0.05),DF组和DOF组之间无显著差异;DOF组Tb.Sp显著高于CF组和DF组(P<0.05),CF组和DF组之间无显著差异。在骨折后第3周时,DF组和DOF组Tb.N均显著低于CF组(P<0.05),DOF组显著低于DF组(P<0.05);DF组和DOF组Tb.Th显著低于CF组(P<0.05),DF组和DOF组之间无显著差异;DF组和DOF组Tb.Sp显著高于CF组(P<0.05),DOF组显著高于DF组(P<0.05)。4分析Masson染色结果显示,在骨折后第2周时,DF组和DOF组骨性和软骨性骨痂面积比均明显小于CF组(P<0.05),DOF组骨性骨痂面积比与DF组无显著差异,DOF组软骨性骨痂面积比明显小于DF组(P<0.05);骨折后的第3周时,DF组和DOF组骨性骨痂面积比均明显小于CF组(P<0.05),DOF组明显小于DF组(P<0.05),CF、DF和DOF三组间软骨性骨痂面积比无显著差异。5分析ColⅡ在骨折端骨痂内的表达显示,在骨折后第2周时,DF组和DOF组ColⅡ的表达均要显著低于CF组(P<0.05),DOF组显著低于DF组(P<0.05);在骨折后第3周时,DOF组ColⅡ的表达显著低于CF组和DF组(P<0.05),CF组和DF组之间无显著差异。分析Caspase-3在骨折端骨痂内的表达显示,在骨折后第2周时,DF组和DOF组Caspase-3的表达均显著高于CF组(P<0.05),DOF组显著高于DF组(P<0.05);第3周时,DF组和DOF组Caspase-3的表达均显著高于CF组(P<0.05),DOF组与DF组之间无明显差异(P<0.05)。第三部分雷奈酸锶联合胰岛素对双侧卵巢切除2型糖尿病大鼠骨折愈合的影响目的:以2型糖尿病并双侧卵巢切除股骨闭合性骨折大鼠模型为基础,研究单独应用胰岛素或联合雷奈酸锶治疗对于其骨折愈合的影响。方法:1 80只健康雌性SD大鼠,2月龄,所有实验大鼠被随机分为5组(n=16):骨折对照组(control fracture,CF)、2型糖尿病骨折组(T2DM+fracture,DF)、2型糖尿病并骨质疏松骨折组(T2DM+Osteoporosis Fracture,DOF)、胰岛素干预组(T2DM+Osteoporosis+Fracture+Insulin,DOFI)和胰岛素联合雷奈酸锶干预组(T2DM+Osteoporosis+Fracture+Insulin+Strontium ranelate,DOFIS)。2大鼠在骨折第2、3周行X线检查后被处死并取材。行Micro-CT检测后,骨组织彻底脱钙,利用番红O-固绿染色分析骨痂内骨性和软骨性骨痂所占骨痂总面积的比值;利用TRAP染色,分析单位骨痂面积内破骨细胞的数量;并利用免疫组织化学方法分析OCN、ColⅠ在骨痂内的表达情况。结果:1.T2DM模型建立后,DF组、DOF组、DOFI组及DOFIS组血糖均明显高于CF组,给予胰岛素干预后,DOFI组及DOFIS组血糖值趋于正常水平,并控制平稳。2.骨折后2周时,DF组和DOF组的骨折愈合X线评分均明显低于CF组(P<0.05),DF组和DOF组之间无显著差异,DOF组、DOFI组及DOFIS组之间无显著差异;骨折后3周时,CF组、DF组、DOFI组及DOFIS组骨折愈合X线评分均显著高于DOF组(P<0.05),CF组显著高于DF组(P<0.05),而DOFI组及DOFIS组之间无显著差异。3.Micro-CT检测显示,在骨折后第2周时,DF组和DOF组BMD、BV,TV和BV/TV均明显低于CF组(P<0.05),DOF组BV,TV和BV/TV显著低于DF组(P<0.05),DF组和DOF组之间BMD无显著差异;在骨折后第3周时,DF组和DOF组BMD、BV和BV/TV均明显低于CF组(P<0.05),DOF组BMD、BV和BV/TV均明显低于DF组(P<0.05),CF、DF组和DOF组三组间TV无显著差异。在骨折后第2周时,DOF组、DOFI组和DOFIS组之间BMD无显著差异,DOFI组和DOFIS组BV,TV和BV/TV显著高于DOF组(P<0.05),DOFI组和DOFIS组之间无显著差异;在骨折后第3周时,DOF组、DOFI组和DOFIS组之间TV无显著差异,DOFI组和DOFIS组BMD、BV和BV/TV均显著高于DOF组(P<0.05),但DOFI组和DOFIS组之间无显著差异。4.分析番红O-固绿染色结果可见,在骨折后第2周时,DF组和DOF组骨性骨痂面积比均明显小于CF组(P<0.05),DF组和DOF组之间无显著差异,DOF组、DOFI组和DOFIS组之间无显著差异;在骨折后第3周时,DF组和DOF组骨性骨痂面积比均明显小于CF组(P<0.05),DOF组明显小于DF组(P<0.05),DOFI组和DOFIS组明显大于DOF组(P<0.05),DOFI组和DOFIS组之间无显著差异。在骨折后第2周时,DF组和DOF组软骨性骨痂面积比均明显小于CF组(P<0.05),DOF组明显小于DF组(P<0.05),DOFI组和DOFIS组明显大于DOF组(P<0.05),DOFI组和DOFIS组之间无显著差异;在骨折后第3周时,各组间软骨性骨痂面积比均无显著差异。5.分析骨痂内TRAP染色结果可见,在骨折后第2、3周,DF组和DOF组单位骨痂面积内TRAP染色阳性的破骨细胞数量均明显高于CF组(P<0.05),DOF组明显高于DF组(P<0.05);在第2周时,DOF组、DOFI组和DOFIS组之间单位骨痂面积内TRAP染色阳性的破骨细胞数量无明显差异,在第3周时,DOFI组和DOFIS组单位骨痂面积内TRAP染色阳性的破骨细胞数量明显低于DOF组(P<0.05),DOFIS组明显低于DOFI组(P<0.05)。6.分析免疫组化结果可见,在骨折后第2周时,DF组和DOF组OCN、Col I的表达均显著低于CF组(P<0.05),DF组和DOF组之间无明显差异;在骨折后第3周时,DF组和DOF组OCN、Col I的表达均显著低于CF组(P<0.05),DOF组显著低于DF组(P<0.05)。在骨折后第2周时,DOFIS组OCN、Col I的表达均显著高于DOF组和DOFI组(P<0.05),DOF组和DOFI组之间无明显差异;在骨折后第3周时,DOFI组和DOFIS组OCN、Col I的表达均显著高于DOF组(P<0.05),DOFI组和DOFIS组之间OCN的表达无显著差异,DOFIS组Col I的表达显著高于DOFI组(P<0.05)。结论:1.应用高脂饲料饮食联合低剂量STZ注射可以成功建立T2DM动物模型,且此动物模型符合人类T2DM发病特点;采用骨组织影像学、组织形态学和免疫组织化学方法分析后发现,T2DM对于骨折愈合早期阶段骨痂内的血管生成有明显的抑制作用,这可能是其骨折愈合发生延迟的重要原因。2.在T2DM动物模型基础上行双侧卵巢切除术,可使其骨折愈合早期阶段的骨痂面积明显缩小,骨痂内新生骨质的空间微结构进一步损害,骨折愈合发生延迟,这可能与其增加骨痂内软骨细胞凋亡,抑制其软骨内成骨过程有关。3.单独胰岛素治疗可促进双侧卵巢切除T2DM大鼠骨折愈合进程,改善其骨折端骨痂内的骨量及微结构,而其促进骨形成和抑制骨吸收的作用可能是此结果的重要原因;在此基础上,联合应用雷奈酸锶干预,虽然表现出可进一步促进骨形成和抑制骨吸收的作用,但是在本实验周期及药物剂量的前提下,其对于骨折愈合过程和骨痂内的骨量及微结构并没有明显的改善。