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目的:使用网络药理学的分析方法,分析肝癌蛋白质组数据并筛选出肝癌预后相关的靶点。联合毒痰瘀脾肾虚方的有效成分信息,构建“毒痰瘀脾肾虚方-疾病靶标”网络。以此为依据分析该复方发挥作用的机制并进行实验验证。方法:1.获得肝细胞癌组织和癌旁组织的蛋白表达数据从CPTAC（clinical proteomic tumor analysis consortium）数据库获得165例肝细胞癌组织和癌旁组织的蛋白表达数据。将蛋白质组数据整理成表达矩阵并通过加权共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis,WGCNA）构建共表达网络,然后将肿瘤组织中表达规律相似的基因划归到相同的基因模块中后,对基因模块与肿瘤组织进行相关性分析并找出与癌症相关性最强的基因模块。整理肝癌转录组数据并进行差异分析,筛选出在肿瘤组和对照组存在显著表达差异（P＜0.05）的基因。在TCMSP（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform）数据库根据OB≥30%且DL≥0.18的标准,筛选叶下珠、半枝莲、蛇舌草、天葵子、旋复花、皂角刺、丹参、姜黄、党参、炙黄芪、白术、生地、续断、沙苑子中的有效成分及其对应靶点信息。联合蛋白质组WGCNA分析结果,转录组差异分析结果以及中药有效成分信息,构建“毒痰瘀脾肾虚方-疾病靶标”网络。对筛选出的靶标蛋白进行GO（Gene Ontology）富集分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析以找出该复方有效成分所调控的相关通路。将靶标构建成蛋白互作网络（protein-protein interaction network,PPI）,用Cytoscape整理PPI网络,筛选出共表达网络中十个核心基因。联合临床数据对核心基因进行生存分析,并筛选出与预后生存时间相关的核心基因。从PDB（Protein Data Bank）数据库获得蛋白分子的结构,从Pub Chem（Biological activity data of small organic molecule）数据库获得药物分子的结构,然后用Pymol在计算机上模拟分子结合用以说明该作用机制理论上可行性。2.实验验证分析结果培养HepG2肝癌细胞和Hep3B肝癌细胞,筛选毒痰瘀脾肾虚方有效成分,按照一定浓度给药后,分别收集24小时、48小时和72小时的肝癌细胞,流式细胞术和TUNEL染色法检测细胞凋亡状况。同时收集给药后24小时、48小时和72小时的肝癌细胞,采用q PCR检测给药后细胞内MMP2、MMP9和GPX4 m RNA的表达,Western Blot检测给药后细胞内MMP2、MMP9和GPX4蛋白含量。结果:1.根据蛋白质组数据WGCNA分析结果、转录组差异分析结果和TCMSP数据库的药物分子信息共同筛选,最终有26个基因被确定为关键靶标。GO富集分析的结果显示,这26个基因主要富集在细胞膜微粒、染色体区和染色体端粒等位置。这些基因参与蛋白乙酰转移酶结合、谷胱甘肽结合和寡肽结合等反应。并且在细胞应对外界刺激和环境变化的过程中发挥作用。KEGG富集分析的结果显示,这些基因主要富集在癌受体激活和细胞周期等通路。PPI共表达网络和生存分析的结果显示毒痰瘀脾肾虚方中的汉黄芩素、木犀草素、槲皮素和圣草酚通过与FN1和HMOX1结合,发挥抑制肝癌细胞的增殖并促进肝癌细胞凋亡的作用。经计算机模拟验证,汉黄芩素与FN1结合发挥作用,而木犀草素、槲皮素和圣草酚则与HMOX1结合发挥作用。2.TUNEL细胞染色和流式细胞术结果显示,木犀草素处理组、槲皮素处理组和圣草酚处理组在给药24小时后细胞凋亡率显著高于对照组,细胞凋亡的数量会随时间延长而上升。qPCR结果显示,GPX4的mRNA表达量显著减少,但MMP2和MMP9的m RNA表达量会随给药时间延长而减少。Western Blot结果显示,肝癌细胞在给药48小时后受HMOX1的调控GPX4蛋白表达量显著减少,而与FN1相关的MMP2和MMP9的表达量未发生显著变化。结论:毒痰瘀脾肾虚方中木犀草素、槲皮素和圣草酚通过与HMOX1结合,发挥促进肝癌细胞凋亡的作用。而FN1理论上可以与汉黄芩素结合,但本研究中与FN1相关的MMP2和MMP9的表达量并未发生显著变化。