目的:急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一类起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病,目前的基于骨髓血细胞形态特征的诊断方法不利于疾病的早期发现,且诊断结果重复性差。大量研究发现细胞外micro RNA(mi RNA或mi R)富集在外泌体中,且受其表面膜的保护而具有很好的稳定性,是一种理想的分子标志物,目前多种实体肿瘤均已检测到肿瘤特异性外泌体mi RNA(exosomal mi RNA)。然而,AML患者血浆exosomal mi RNA的表达未见报道。为此,本研究探讨AML患者血浆exosomal mi RNA表达谱差异及新的exosomal mi RNA序列,筛选出AML特异性的exosomal mi RNA分子标志物,并初步了解其功能,为阐明AML白血病发生与发展的分子机制,研发新的无创诊断方法、新的诊断标记物和有效治疗AML的方法具有十分重要和深远的意义。方法:1、利用Total Exosome Isolation Kit外泌体提取试剂盒从23例AML组初发患者(AML组)和23例正常人(对照组)血液的血浆中分离外泌体。2、通过透射电镜观察外泌体形态大小;利用ZETASIZER Nano series-Nano-ZS仪器分析外泌体粒径大小;利用流式细胞仪检测外泌体表面蛋白CD63和CD81的表达,以鉴定外泌体。3、通过高通量测序检测AML组和对照组血浆外泌体mi RNA,得到两组样本已知mi RNA的表达量。4、利用Mireap预测软件进行新miRNAs分析。5、通过RPM公式将mi RNA表达量归一化到同一数量级,以分析两样本差异表达的mi RNA。6、结合文献从两组显著差异表达的mi RNA中选取mi R-155-5p、mi R-335-5p、mi R-451a及xxx-m0038-5p(新mi RNA),通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR)对两组(各23例)的血浆外泌体样本进行验证。7、利用mi RNA靶基因预测软件预测差异表达mi RNA的靶基因,并对预测的靶基因进行GO(Gene Ontology)分析和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)生物信息学分析,初步了解靶基因的主要生物学功能及参与的信号转导通路。结果:1、本研究分离出的外泌体呈大小不一、分布不均匀的圆形或类圆形浅灰色结构;直径在30~150nm之内;其表面蛋白CD63表达阳性率为86.8%,CD81表达阳性率为92.9%,结果均呈阳性。2、通过高通量测序技术,成功构建了AML组与对照组血浆外泌体mi RNA表达谱,共鉴定出已知的mi RNA有537个,其中表达水平在两组有明显差异的mi RNA有211个,与对照组相比,表达上调的mi RNA有118个,表达下调的mi RNA有93个。有41个mi RNA在两组的表达量差异高于5倍以上,其中35个mi RNA在AML组呈显著表达上调,6个mi RNA在AML组呈显著表达下调。3、通过Mireap预测软件,AML组预测出可能为新mi RNA的序列35个,对照组预测出可能为新mi RNA的序列221个,而同时在两组表达的只有7个,其中只有2个(xxx-m0038-5p和xxx-m0022-3p)具有显著差异性。4、经实时荧光定量PCR验证,mi R-155-5p、mi R-335-5p、mi R-451a及xxx-m0038-5p(新mi RNA)在两组的血浆外泌体样本中的表达差异显著,均高于对照组10倍以上,与测序结果一致,证明测序结果准确可靠。5、通过Target Scan、mi RDB、mi Randa三种软件以及高通量CLIP-seq数据库,对最显著的前10个差异表达的miRNAs进行靶基因预测,共预测出1596个靶基因,再针对这些靶基因进行GO和KEGG分析,发现这些靶基因主要在调控RNA生物合成过程、转录调控及DNA-模板、调节细胞生物合成的过程、基因表达调控等GO条目显著富集,并鉴定出Fox O、MAPK、Hippo信号通路以及HTLV-I感染等17个显著富集的KEGG信号通路。结论:1、本研究共筛选出211种表达水平有明显差异的外泌体miRNAs,其中有41个mi RNA在两组的表达量差异高于5倍以上,为外泌体mi RNA在AML发病机制的研究以及研发新的无创诊断方法、新的诊断标记物提供依据。2、外泌体mi R-155-5p、mi R-335-5p、mi R-451a很有可能为AML早期诊断的分子标志物。发现新mi RNA——xxx-m0038-5p,可能是AML相关的重要mi RNA。4、AML血浆外泌体mi RNA的靶基因聚集的生物学功能多数参与生物调控以及癌症形成的相关通路。