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目的:阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)是老年人常见的神经系统变性疾病,是痴呆最常见的原因。目前AD的发病机制还不十分明确。AD的典型病理改变为老年斑(Senile Plaques,SP)、神经原纤维缠结(Neurofibrillary tangle,NFT)和选择性神经原丢失,其中神经原纤维缠结(NFT)与AD的痴呆程度密切相关。NFTs主要由双股螺旋丝(PHF)所组成,其主要成分是过度磷酸化的tau蛋白。tau蛋白是一种正常存在于神经元轴突和细胞质的磷脂蛋白,作为微管相关蛋白,tau蛋白能够促进微管蛋白聚集形成微管,并增强微管蛋白的稳定性,有助于细胞的生长发育。Tau蛋白的活性受磷酸化和去磷酸化作用调节。蛋白磷酸酯酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)是脑内促进tau蛋白去磷酸化的主要磷酸酯酶。研究表明PP2A的活性和表达在AD脑内受累区域明显下调,在许多模型中抑制PP2A都可产生与AD脑内相似的tau异常高度磷酸化和聚集,PP2A催化亚基在L309甲基化的减少或在Y307的磷酸化都可引起tau的过磷酸化,tau异常高度磷酸化是AD的早期表现。因此对tau蛋白过度磷酸化的抑制是AD治疗的一个有效靶点。脑源性神经营养因子(Brain derived neurotrophic factor,BDNF)是Barde等于1982年从猪脑中分离纯化的一种碱性蛋白,其免疫阳性神经元广泛分布于大脑皮层、海马、基底前脑、纹状体、隔区、下丘脑和小脑,但表达最集中的部位是海马CA2、CA3区的锥体细胞层和齿状回颗粒细胞层。BDNF能促进多种神经元的存活和生长发育;提高细胞内抗氧化酶活性,对抗自由基;通过抑制兴奋性氨基酸的细胞毒性,抑制细胞凋亡;并且在认知、学习和记忆形成中都起着重要作用。AD患者脑内受累区域BDNF及其受体表达明显降低。目前研究认为像AD这样的神经变性性智能减退与神经营养因子轴突运输缺乏、神经营养因子的分布失衡以及功能失调密切相关。因此,本研究将外源性BDNF作用于PP2A抑制剂(Okadaic acid,OA)处理的SH-SY5Y细胞以及AD模型大鼠,研究外源性BDNF对OA诱导的tau过磷酸化、脑细胞凋亡及大鼠行为学的影响,探讨BDNF对AD脑保护可能的作用机制。研究方法:1.动物实验:健康成年雄性Wistar大鼠60只,随机平均分为:(1)正常对照组(n=10)、(2)假手术组(n=10)、(3)OA组(n=10)、(4)BDNF组(n=10)、(5)PI-3K抑制剂组(n=10)及(6)TrkB抑制剂组(n=10)。采用双侧海马内立体定位注射方法建立动物模型:假手术组每侧海马注入2μl生理盐水;OA组每侧海马注入2μl OA(0.2μmol/L);BDNF组每侧海马注入2μl OA(0.2μmol/L)+2μl BDNF(50 ng/ml);PI3K抑制剂组每侧海马注入2μl OA(0.2μmol/L)+2μl BDNF(50 ng/ml)+2μl LY294002;trkB抑制剂组每侧海马注入2μl OA(0.2μmol/L)+2μl BDNF(50 ng/ml)+2μl K252a。注射24 h后通过Morris水迷宫实验检测大鼠行为学改变。每组随机选取大鼠,脑内灌注后取材用作TUNEL染色检测细胞凋亡、免疫组化检测caspase-3、bcl-2、bax、突触素等表达。其余大鼠直接断头取海马,-80℃冻存,用作Western blot检测tau-1、tau-5、PHF-6、PP2A、PP2Ac-Yp307、GSK-3β、PI3K、AchE等表达及RT-PCR检测BDNF mRNA、trkB mRNA、SYN mRNA表达。2.细胞培养:将培养的SH-SY5Y细胞用终浓度为40 nmol/L的OA处理24 h,再加入相应浓度的BDNF、LY294002、K252a作用15 min,然后收集细胞分别进行免疫荧光检测AT8和PP2Ac-Yp307表达,MTT实验检测细胞存活率,PI单染后流式细胞仪检测细胞凋亡。.结果:1.大鼠Morris水迷宫实验OA组、trkB抑制剂组大鼠逃避潜伏期较正常对照组及假手术组明显延长,BDNF组及LY294002组大鼠逃避潜伏期较OA组、K252a组显著减少,但仍长于正常对照组及假手术组(p﹤0.05)。2.大鼠海马TUNEL染色正常对照组及假手术组大鼠海马CA3区几乎未见TUNEL染色阳性细胞;OA组、K252a组、LY294002组大鼠海马CA3区阳性细胞明显增多;BDNF组TUNEL阳性细胞减少,但仍明显多于对照组及假手术组(p﹤0.05)。3.大鼠海马caspase-3免疫组化正常对照组及假手术组大鼠海马CA3区可见少量caspase-3阳性细胞;OA组、K252a组、LY294002组大鼠海马CA3区caspase-3阳性细胞明显增多;BDNF可使caspase-3阳性细胞减少,但仍明显多于对照组及假手术组(p﹤0.05)。4.大鼠海马突触素表达正常对照组及假手术组大鼠海马CA3区可见大量突触素表达;OA组、K252a组、LY294002组突触素表达明显减少;BDNF可增加突触素表达(p﹤0.05)。5.大鼠海马BDNF mRNA、trkB mRNA及SYN mRNA表达OA组、K252a组、LY294002组BDNF mRNA、trkB mRNA及SYN mRNA表达较正常对照组明显减少;BDNF组上述指标表达有所增加,基本达到正常对照组水平(p﹤0.05)。6.大鼠海马tau蛋白磷酸化检测正常对照组、假手术组仅有微量过磷酸化的tau蛋白表达AT8(p-Ser199/202),PHF-1(p-Ser396/404),PHF-6(p-Thr231),OA组、K252a组、LY294002组各位点磷酸化的tau蛋白表达明显增加,外源性BDNF可减少tau蛋白上述各位点的磷酸化(p﹤0.05);OA组tau-1(Ser199/202)表达较正常对照组和BDNF组明显减少(p﹤0.05),后二组表达基本无差异(p﹥0.05);各组tau-5(总tau)表达无差异(p﹥0.05)。7.大鼠脑内tau蛋白磷酸化相关酶的测定OA组、K252a组、LY294002组PP2A、p-AKT表达较正常对照组明显减少,而PP2Ac-Yp307、GSK-3β表达较正常对照组明显增加;BDNF组PP2Ac-Yp307表达减少,PP2A表达增加,p-AKT表达增加,而GSK-3β表达减少(p﹤0.05)。8.SH-SY5Y细胞tau蛋白磷酸化及相关酶的测定各组细胞检测的磷酸化位点与大鼠检测位点相同,tau蛋白在各位点的磷酸化表达结果的组间差异与大鼠海马检测结果相同,但当用GSK-3β抑制剂与BDNF共同作用于OA处理过的细胞时,BDNF的作用被取消了。9.SH-SY5Y细胞AT8及PP2Ac-Yp307免疫荧光检测正常对照组细胞几乎未见AT8及PP2Ac-Yp307阳性表达;OA组可见大量AT8(胞浆绿色荧光)及PP2Ac-Yp307(胞浆红色荧光)阳性表达,且二者表达具有伴行性;BDNF组荧光表达较OA组有所减少。10.SH-SY5Y细胞MTT实验检测细胞存活率OA处理组细胞存活率较正常对照组明显降低,BDNF组明显提高细胞存活率(p﹤0.05)。11.PI单染后流式细胞仪检测细胞凋亡正常对照组有少量细胞凋亡;OA组细胞凋亡率明显增加;BDNF可明显降低细胞凋亡率(p﹤0.05)。结论:1.OA注射引起tau蛋白敏感位点AT8、PHF-1、PHF-6的过磷酸化,外源性BDNF可使其减少。2.OA注射后PP2A催化亚基磷酸化增加导致PP2A活性降低,GSK-3β活性升高,BDNF通过激活PI3K/AKT通路抑制GSK-3β活性,并且减少PP2A催化亚基磷酸化,提高PP2A活性,从而减少tau蛋白磷酸化。3.海马立体定位注射OA后引起大鼠立体空间定位能力的明显减退,外源性BDNF可通过减少tau蛋白过磷酸化、抑制GSK-3β活性减少caspase-3表达,从而减少细胞凋亡、增加OA注射后引起的大鼠海马BDNF mRNA及trkB mRNA表达的减少、以及增加OA注射后大鼠海马突触素的表达等多方面来改善大鼠的行为学。