中药材有效成分的绝大多数都来源于次生代谢产物,利用细胞工程(体细胞杂交)及次生代谢的基因工程,来改良中药材品质的研究具有重要意义。体细胞杂交可转移并提高药效成分含量,实现药用成分合成基因在不同科、属、种间的相互转移,获得含有高含量异源药效成分的体细胞杂种。目前有关中药材体细胞杂交研究已有一些成功的例证,其中狭叶柴胡与川西獐牙菜体细胞杂交已获得杂种植株(向凤宁等,2003),但是杂种中异源染色体/DNA的存在方式、异源有效成分合成相关基因表达与异源有效成分积累的相关性尚未进行深入分析。次生代谢产物关键酶基因的克隆及转化是植物次生代谢工程的研究热点。通过超量表达相关限速酶基因,来提高目标代谢物产量是植物代谢工程的主要策略之一。目前在基因水平上萜类合成途径研究较为清楚,单萜类代谢途径中的一些基因已被克隆,但有关中药材有效成分合成相关基因的发掘才刚刚开始。高寒藏药材——川西獐牙菜(Swertia mussotii Franch)专治黄胆性肝炎及病毒性肝炎,野生资源匮乏。其主要有效成分为芒果苷、獐牙菜苦苷和龙胆苦苷。獐牙菜苦苷(swertiamarin)和龙胆苦苷(gentiopicroside)属于环烯醚萜类(iridoid)化合物,它们的生物合成途径尚未完全已知。,香叶醇(geraniol)是环烯醚萜类化合物(iridoid)生物合成途径的重要组分,它的氧化被认为是烯醚萜类化合物合成途径中第一个限速步骤,此反应由香叶醇-10羟化酶(geraniol 10-hydroxylase, G10H)催化香叶醇而生成10羟基-香叶醇(10-hydroxygeraniol)。本论文开展了狭叶柴胡与川西獐牙菜体细胞杂交研究,获得了体细胞杂种再生植株；分析了不同杂种中的药效成分含量；比较了川西獐牙菜(供体)染色体、核基因组DNA及SmG10H基因在不同杂种细胞系中的差异；初步确定了杂种中供体核基因组组成及SmG10H基因表达模式与异源药效成分含量的关系。探讨了UV剂量对杂种生长、染色体消减和片段化的影响。通过狭叶柴胡与川西獐牙菜体细胞杂种及双亲细胞色素P450(cytochrome P450)基因片段序列分析,发现了杂种中存在一个与川西獐牙菜香叶醇-10羟化酶(G10H)基因同源的片段。在此基础上,首次分离了川西獐牙菜的香叶醇-10羟化酶的全长新基因(SmGl0H)；分析了在诱导子茉莉酸甲酯(MeJA)处理下,环烯醚萜类化合物代谢途径中相关酶基因表达水平的差异及其与药效成分积累的关系。完成了SmG10H在原核大肠杆菌、真核酵母中的功能验证及酶活力测定；实现了SmG10H对川西獐牙菜胚性愈伤组织的转化,获得了獐牙菜苦苷和龙胆苦苷含量高的转基因植株,为进一步研究转基因植株及后代环烯醚萜类化合物代谢的分子机制奠定了基础。主要研究过程及实验结果包括：1.狭叶柴胡与川西獐牙菜体细胞杂交1.1体细胞杂种细胞系及其再生植株的获得以高寒藏药材川西獐牙菜原生质体为供体,经380μW/cm2的紫外线照射0sec、30 sec、1 min、2 min和3 min后,与狭叶柴胡原生质体(受体)在PEG诱导下进行融合,共产生194块愈伤组织,其中,3个克隆再生出完整绿苗,并移栽成活。经染色体和同工酶分析,证明了104个细胞系的杂种性质。1.2体细胞杂种核基因组组成分析1.2.1杂种染色体和GISH分析双亲染色体数目：狭叶柴胡愈伤组织染色体数目为11-12条,川西獐牙菜愈伤组织染色体数目为17-20条,杂种染色体数目为11-20条。GISH结果显示：杂种细胞系B24(具有分化能力,可再生植株)和C10(无分化能力)中狭叶柴胡染色体均为11-13,完整川西獐牙菜染色体及其染色体小片段数目分别为：0-3/1-3和0-1/5-9。表明,随UV-射线剂量的增加,完整川西獐牙菜染色体数目逐渐减少,供体染色体小片段数目增加,证明了UV剂量在杂种川西獐牙菜染色体消减及片段化中的作用。1.2.2 RAPD分析200个随机引物的PCR扩增分析表明：1)杂种细胞系均含有双亲特征谱带或新带；2)杂种中保留了91.2%-96.0%的狭叶柴胡DNA谱带、0.2%-2.6%的川西獐牙菜供体DNA谱带。表明体细胞杂种的核基因组以受体狭叶柴胡为主,受体对杂种的核基因组贡献大于供体；3)除C10外,不同杂种的供体带比例及新带比例差别较小,表明杂种中供体DNA组成相近；4)杂种中供体DNA和重组DNA含量与紫外照射的时间成正相关。1.3体细胞杂种中药效成分含量及醇溶性成分的代谢谱变化分析HPLC测定发现,所有的74个杂种细胞系中均不含有龙胆苦苷,杂种B24、B27、B132、C18、C26、C47和C124含有獐牙菜苦苷(含量为0.0074-0.0812 mg/g),杂种克隆B6、B40、B56、C10和C121仅含芒果苷(含量为0.0863-0.8168 mg/g),其中,B6、B56和C10含量高于亲本川西獐牙菜(0.6641 mg/g),表明,供体川西獐牙菜的獐牙菜苦苷和芒果苷已转入受体狭叶柴胡中。GC-MS分析表明,杂种中含有大部分柴胡(受体)的特征性物质,少量的川西獐牙菜特征性物质及非双亲物质(新物质)。1.4细胞色素P450基因在杂种及双亲中的存在方式利用CYP76的简并引物对川西獐牙菜、狭叶柴胡及其体细胞杂种细胞系A6、A67、B24、B27、B132、C18、C26、C47和C124进行了RT-PCR扩增,获得了11个长度约1100-1200bp的G1OH基因的同源片段。基因片段序列比对发现,狭叶柴胡的G10H与川西獐牙菜的同源性为45.7%；杂种B24、B27、B132、C18、C26、C47和C124的G1OH与川西獐牙菜(SmG1OH)的完全相同,表明它们可能来源于供体川西獐牙菜。杂种A6、A67的G10H与狭叶柴胡的同源性(84.1%)远高于与川西獐牙菜的同源性(53.1%),表明,该基因片段可能来源于狭叶柴胡。研究表明,G1OH除了参与吲哚生物碱的合成,亦可能参与了环烯醚萜类代谢合成,而抗肝炎药效成分獐牙菜苦苷及龙胆苦苷均为此类物质,因此,该基因亦可能参与了它们的合成,有必要作为本实验中的目标基因进行深入研究。1.5 SmG10H在体细胞杂种中的表达及其与獐牙菜苦苷含量的关系半定量RT-PCR分析表明,SmG10H达水平：杂种B24、B132、C47低于亲本川西獐牙菜；B24和B132接近,但高于C47；A6未见表达。表明,不同杂种SmG10H的表达水平存在明显差异。HPLC分析表明,杂种中獐牙菜苦苷含量(0.0074-0.0812 mg/g)低于亲本川西獐牙菜(0.9298 mg/g),其中B24和B132高于C47；A6未检测出獐牙菜苦苷。表明,A6的SmG10H未表达,其不含獐牙菜苦苷；B24、B132表达水平较高,其獐牙菜苦苷含量亦较高；C47的表达水平低,其含量亦低。由此而知,杂种SmG10H表达与獐牙菜苦苷含量呈正相关。总之,含有獐牙菜苦苷体细胞杂种中存在可能来源于供体川西獐牙菜SmG1OH,该基因的表达量与杂种獐牙菜苦苷成正相关。2.川西獐牙菜环烯醚萜类化合物相关基因的克隆和功能验证2.1香叶醇10-羟化酶(SmG10H)基因的克隆采用RACE-PCR技术,从川西獐牙菜中分离了1个香叶醇10-羟化酶基因的全长cDNA,命名为：SmG1OH(CYP76B10,Genbank号为GU168041)。序列分析表明,它们的ORF核苷酸长度为1488 bp,编码496个氨基酸,蛋白质分子量均为55.5 kDa。该基因全长为1637 bp,在882-1030 bp位置有一个大小为149 bp的内含子。系统树分析表明,该基因氨基酸序列在进化上与长春花的CYP76B6具有高的同源性(80.2%)。2.2 SmG1OH在川西獐牙菜基因组中的分布Southern blot分析表明,SmG1OH在川西獐牙菜基因组中以单拷贝的形式存在。2.3环烯醚萜类化合物代谢途径中相关基因的表达分析2.3.1 SmG1OH在川西獐牙菜中的表达分析半定量RT-PCR和Real-time PCR分析表明,SmG1OH在川西獐牙菜叶片中高表达,在根和茎中的表达量甚微。SmG1OH在叶中的表达量是根中的24.9倍,茎中的10.2倍。2.3.2 MeJA对环烯醚萜类化合物合成相关基因表达及药效成分含量的影响克隆环烯醚萜类化合物合成途径相关的6个基因片段：SmG1OH、DXS、HMGR、IPP-iso和MECS基因,设计特异性引物,分析MeJA处理下,上述基因的表达变化。1)不同浓度MeJA诱导的SmGl0H表达选用0、10、20、50、100和150μM的MeJA处理川西獐牙菜再生植株,取处理6h的材料进行半定量RT-PCR分析,结果表明,在50μM下SmG1OH表达量高,为适宜的处理浓度。MeJA处理可显著提高SmG10H表达。2)不同时间MeJA诱导的目标基因表达模式选用50μM的MeJA处理川西獐牙菜,分别取0 h、6 h、12 h、24 h、36 h的再生植株进行半定量RT-PCR和Real-time PCR分析,结果表明,再生植株在MeJA处理6 h,SmG10H、DXS、HMGR.IPP-iso和MECS基因表达开始上调,在24小时时表达量最高,然后呈现下降趋势；在MeJA处理24 h后,IPP-iso. MECS表达最强,然后呈现下降趋势。3)MeJ处理川西獐牙菜对药效成分含量的影响川西獐牙菜再生植株在50uM MeJA处理不同时间下的HPLC分析表明,随着处理时间的延长,獐牙菜苦苷、龙胆苦苷及芒果苷的含量均持续增加,在24 h-36 h间其增长率最高,而到15 d时含量达到最高,分别为2.62 mg/g,0.67 mg/g和0.21 mg/g,比对照(未处理)分别增加了2.5倍,2.2倍和2.7倍。表明,MeJA能够显著提高川西獐牙菜抗肝炎药效成分含量。4)MeJA处理下SmG1OH表达与环烯醚萜类化合物含量的关系MeJA处理12 h后,SmG1OH表达水平高,獐牙菜苦苷和龙胆苦苷含量亦增加,表明,SmG10H表达水平与环烯醚萜类化合物含量呈正相关。2.4 SmG10H基因的功能鉴定2.4.1 SmG10H在原核细胞大肠杆菌的表达验证1)表达产物的蛋白特性分析构建了带有SmG10H的大肠杆菌表达载体pET28a-SmG10H,转化到表达型菌株BL21中,阳性克隆经IPTG诱导,提取蛋白进行SDS-PAGE分析,均获得了分子量大小为60 kDa的SmG1OH谱带。对带有His标签的SmG10H进行纯化和等电聚焦实验,发现该蛋白等电点为8.63±0.3。2)表达产物的LC-MS分析对纯化的SmG10H蛋白在体外加入底物香叶醇后进行液相-质谱法(LC-MS)分析,发现催化反应的目标产物同10-hydroxygeraniol标准品均在8.3 min处存在一个峰,质谱分析证实该峰为10羟基香叶醇。从而表明,SmG1OH在体外具有催化底物香叶醇生成10羟基香叶醇的活性。3)酶活力测定为了进一步测定酶活力大小,对纯化蛋白体外反应的催化条件进行了优化,确定其最佳催化条件为：pH7.7±0.1,温度为30℃。在此条件下,测得该蛋白的酶活力大小为0.36±0.02(pkat/mg protein)。2.4.2 SmG10H在真核细胞酵母的功能验证1)SmG10H在酵母的表达验证构建了酵母表达载体pPICZa-SmG1OH,转入毕赤酵母GS115中,SDS-PAGE分析发现,转基因酵母菌与对照相比均含有SmG10H合成酶谱带,分子量大小为60.0 kDa。分离转SmG10H酵母的膜蛋白,加入底物香叶醇,通过LC-MS分析发现,该膜蛋白的催化产物同10羟基香叶醇标准品的保留时间均为8.3 min,且质谱峰型一致。证明SmG10H能够表达,其产物具有酶活性,可在酵母中直接催化底物香叶醇生成10羟基香叶醇,而未转基因酵母未检测出10羟基香叶醇。2)SmG10H酶催化特性在体外催化反应中,加入100μgSmG1OH蛋白,反应时间为30 min时,催化反应的目标产物成线性。以此为最佳反应条件,对转基因酵母SmG1OH蛋白进行体外酶催化活性分析,测得该酶的Km=5.2±0.2μM。2.4.3 SmG10H在植物中的功能验证1)川西獐牙菜胚性愈伤组织的基因转化利用基因枪法,将过表达载体pBGWF7-SmG10H和RNAi载体pK7GWIWG-SmG10H分别转入培养7 d的川西獐牙菜胚性愈伤组织(分化频率高,达90%以上),暗培养24 h,在高浓度(100mg/L) Kan下筛选出抗性愈伤组织。抗性愈伤组织在IB分化培养基上分化成苗后,用25mg/L Kan进一步筛选再生植株,获得了24株抗性植株(SmG10H的过表达系15株、RNAi系9株)。抗性植株总DNA用35S启动子、ccdB及SmG10H5引物进行PCR检测,鉴定出过表达植株3株、RNAi植株3株。SmG1OH的过表达和RNAi植株转化频率分别为1.6%和2.0%。半定量RT-PCR分析表明,过表达系中SmG10H表达高于对照,而在RNAi系中SmG10H的表达均显著低于对照。2)转基因植株中10-羟基香叶醇及环烯醚萜类含量分析HPLC测定表明,10-羟基香叶醇、獐牙菜苦苷和龙胆苦苷齐含量在SmG10H过表达植株(OS1、OS2、OS3)高于对照植株,而在RNAi植株(R1、R2、R3)中低于对照(WT)；其变化趋势为：R3<R2<R1<WT<OS2<OS1<OS3。其中,OS3的10-羟基香叶醇、獐牙菜苦苷和龙胆苦苷齐含量分别为WT的2.65倍,1.71倍和1.91。由此可见,SmG10H的过表达促进了转基因植株环烯醚萜类物质的积累,反之亦然。表明,该基因为环烯醚萜类化合物合成的一个关键酶基因。