第一部分AMPK及相关信号通路在2型糖尿病血小板中的表达变化目的:探讨2型糖尿病(Type II diabetes mellitus,T2DM)血小板AMPK/m TOR信号通路分子AMPK、S6K1及PI3K信号通路分子Akt的变化。方法:本研究共纳入2016年9月到2017年1月期间在苏州大学附属第一医院内分泌科收治的T2DM患者20例,同时纳入体检中心收治的健康志愿者20例,离心法制备洗涤血小板后,每份标本平均分成两份,其中一份加入20m M AMPK激活剂二甲双胍孵育3min,进行血小板聚集试验,并以同样方法制备血小板用免疫印迹分别检测孵育前后血小板AMPK、S6K1及Akt的磷酸化并定量分析。结果:与正常对照血小板相比,T2DM血小板中AMPK磷酸化水平降低,Akt和S6K1磷酸化水平升高;而在加入20 m M的二甲双胍后,血小板聚集被抑制。免疫印迹结果显示,二甲双胍孵育后T2DM血小板中AMPK磷酸化水平恢复,Akt和S6K1磷酸化水平降低。结论:T2DM血小板中AMPK/m TOR信号通路活性降低,PI3K信号通路活性增加。第二部分AMPK调控血小板活化的作用机制的研究目的:在不同刺激剂存在的情况下,观察血小板AMPK及相关分子的变化;并在胶原诱导的血小板活化模型中,探讨AMPK及相关分子参与的血小板活化信号的传导机制。方法:在体外采用5 m M和20 m M AMPK激动剂二甲双胍(Metformin)处理,分别采用二磷酸腺苷(Adenosine diphosphate,ADP)、胶原(Collagen)和凝血酶(Thrombin)刺激后,记录血小板的聚集和分泌,免疫印迹法检测血小板AMPK、Akt及S6K1的磷酸化并定量。采用胶原诱导的血小板聚集和分泌模型,结合AMPK抑制剂Compound C(10μM)、AMPK激活剂二甲双胍(20m M)、m TOR抑制剂雷帕霉素(10n M)、PI3K抑制剂LY294002(25μM)和c GMP类似物8-p CPT-c GMP(50μM),进一步探讨AMPK/m TOR信号通路的作用及其与PI3K/NO/c GMP信号通路可能的cross-talk(交互作用)。结果:5 m M和20 m M AMPK激动剂二甲双胍处理均能够抑制ADP、胶原和凝血酶诱导的血小板聚集和分泌,而AMPK磷酸化水平升高是可能的作用机制。在胶原诱导的血小板聚集和分泌中,通过Compound C和雷帕霉素分别抑制AMPK和m TOR之后能够逆转二甲双胍对血小板聚集和分泌的抑制效应。免疫印迹检测发现Akt的磷酸化增加,并在加入LY294002抑制PI3K后,可抑制血小板的聚集和分泌。进一步检测PI3K信号通路下游发现,c GMP类似物8-p CPT-c GMP可以取消血小板AMPK激活产生的对聚集和分泌的抑制效应,免疫印迹检测血小板中c GMP依赖的蛋白激酶的底物VASP磷酸化水平增加,证实NO/c GMP信号通路参与到AMPK介导的血小板活化中。结论:在胶原诱导的血小板活化中,AMPK/m TOR信号通路和PI3K信号通路之间存在cross-talk。