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参照NCBI公布的小反刍兽疫病毒疫苗株Nigeria75/1全基因序列(GenBank登录号：X74443),人工合成表达核蛋白的N基因开放阅读框序列并将其插入载体pBluescriptsk,通过PCR扩增,将N基因克隆至pMD19-T载体,经引物设计引入的EcoR Ⅰ和Kpn Ⅰ特异性酶切,将N基因克隆于昆虫杆状病毒表达载体pFastBacHTA,阳性重组质粒命名为pFastBacHTA-PPRV-N,测序结果显示克隆基因片段长度为1578bp,编码525个氨基酸。将pFastBacHTA-PPRV-N转化含有杆状病毒穿梭载体的DH10Bac感受态细胞,得到重组穿梭质粒Bacmid-PPRV-N,在脂质体介导下用Bacmid-PPRV-N转染Sf9昆虫细胞,获得表达PPRV N蛋白的重组杆状病毒VBacmid-PPRV-N。 SDS-PAGE和Western blot分析结果表明该蛋白得到表达,且具有良好的生物活性,分子量大小约为61.3ku。以纯化的Bacmid-PPRV-N重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的致敏脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在PEG作用下融合,经克隆培养和间接ELISA方法筛选,获得了2株能稳定分泌抗小反刍兽疫病毒N蛋白抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为5B11和3H10-3B8。生物学特性鉴定试验表明：5B11和3H10-3B8抗体类型和亚类均为IgG2b；5B11单抗腹水的效价达1：819200,3H10-3B8达1：12800；血清学试验证明2株单抗均能与Bacmid-PPRV-N重组蛋白抗原结合,具有高度的特异性；相加ELISA试验结果显示,5B11和3H10-3B82株单克隆抗体分别识别N蛋白上不同的抗原位点；2株杂交瘤细胞的染色体均为99-104。以Bacmid-PPRV-N重组蛋白和用亲和层析纯化的单抗5B11建立了小反刍兽疫病毒C-ELISA抗体检测方法。通过检测已知为PPRV抗体阳性和阴性的血清对该方法进行条件优化,最终确定抗原用碳酸盐缓冲液以1：1000稀释后包被酶标板,于37℃条件下震荡反应,以含0.5%BSA和0.05%Tween-20的PBS作为稀释液,稀释血清至1：10、单抗至0.17ng/孔的终浓度后一起加到酶标板,使单抗与血清中的PPRV抗体竞争结合N抗原特异性表位,检测结果的临界值通过92份已知为PPRV抗体阴性血清的抑制率分布来确定,最终将临界值确定为50,即92份阴性血清的PI均值加上3倍的标准偏差。基于上述研究成果,先后组装了3个批次的试剂盒。在试剂盒的初步应用中,将自制的试剂盒与国际通用的标准试剂盒(CIRAD-BIOS PPRV rC-ELISA试剂盒)进行比较分析,对自制的PPRV C-ELISA抗体检测试剂盒的使用价值进行了评估。通过对977份临床样品进行检测,结果经统计分析表明：自制的试剂盒与参考试剂盒的符合率为99.38%,说明自制的PPRVC-ELISA抗体检测试剂盒可用于PPR临床检测。