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研究背景和目的乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。近10年乳腺癌的发病率一直处于上升的趋势。虽然随着医疗技术的发展进步,乳腺癌的诊断技术明显提高,女性乳腺癌的死亡率整体上有所下降,但仍有部分乳腺癌患者发现较晚,术后转移率仍高。通过传统的放疗、化疗手段有部分患者获益,但传统的治疗手段存在抗肿瘤效果差、特异性、毒副作用大等缺点。因此,发现新的靶点,研发新的抗肿瘤药物至关重要。目前分子靶向治疗已有很大突破,当今已有多个分子靶向药物在临床应用,目前主要是以表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等为靶点,如贝伐珠单抗等,在临床研究中证实具有一定的临床治疗。而近几年有研究发现,神经纤毛黏连蛋白家族(Neuropilins,简写:NRPs)家族成员的Neuropilin-1,(简写:NRP-1)作为Semaphorin、VEGF及其他因子共受体,其在血管形成、发育和肿瘤的发展、转移的过程中起着重要的调节作用,并与肿瘤的预后密切相关,而Neuropilin-2(简写:NRP-2)是NRPs家族另一个成员,并与NRP-1有44%的同源性。有研究发现NRP2受体广泛表达于人体肿瘤细胞中,并在淋巴管形成以及肿瘤迁移、侵袭、增殖、凋亡及粘附等过程中起重要作用。因此,深入研究NRP-2及其相互作用的信号分子在肿瘤生物学行为过程中的作用及其机制,对寻找肿瘤新的治疗靶点具有重要意义。因此,它有可能成为肿瘤治疗的一个新靶点。目前国内外对NRP-1及NRP-2的研究相对成熟,但是对NRP-2单克隆抗体(NRP-2m Ab)在乳腺癌发生发展过程中的影响研究甚少。本文实验研究主旨是乳腺癌细胞株中检测本实验室制备的抗NRP-2单克隆抗体对乳腺癌细胞生物学行为的影响及其作用机制,为研究发现一种特异针对NRP-2靶标的新型抗肿瘤药物策略奠定实验室基础。实验方法前期本实验室已成功制备了功能性的NRP-2单克隆抗体(NRP-2m Ab),并证实纯度和浓度均较高。通过RT-PCR及Western blotting检测不同乳腺癌细胞株中NRP-2的m RNA水平及蛋白的表达程度,筛选较高表达的一株细胞进行后期的实验;细胞免疫荧光定位检测NRP-2m Ab结合NRP-2的活性及其特异性;CCK8实验检测NRP-2m Ab乳腺癌细胞株生长增殖的影响,并在光镜下观察NRP-2m Ab不同时间段及药物浓度作用后乳腺癌细胞形态的改变;Transwell检测NRP-2m Ab对乳腺癌细胞迁移、侵袭的影响。流式细胞术检测NRP-2m Ab诱发细胞的凋亡情况;通过粘附实验研究抗NRP-2单克隆抗体对高表达NRP-2的乳腺癌细胞粘附作用的影响。并且,探讨抗NRP-2单克隆抗体作用机制:即在乳腺癌细胞粘附于fibronectin((FN))实验中,通过罗丹明-鬼笔环肽染色研究抗NRP-2抗体对粘附细胞应力纤维形成的影响;运用普通免疫共沉淀方法了解NRP-2m Ab与α5β3相互关系;共聚焦免疫荧光显微镜观察NRP-2与p-FAK的共定位,运用普通免疫共沉淀方法了解不同浓度的NRP-2m Ab作用对p-FAK免疫荧光的影响,同时Western blotting检测p-FAK在粘附实验后蛋白水平的表达情况;最后通过Western blotting检测NRP-2m Ab作用后,相关信号通路分子的改变。实验结果结果显示,MDA-MB-231、MCF-7、BT-549、SK-BR-3乳腺癌细胞株上NRP-2抗原均有不同程度的表达,而定位主要在细胞膜上,MDA-MB-231的m RNA及蛋白水平NRP-2的表达均较高;不同浓度NRP-2m Ab有抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞株的生长增殖、细胞的迁移、侵袭及粘附,促进其凋亡的作用,且NRP-2m Ab对MDA-MB-231乳腺癌细胞生长增殖的抑制作用呈浓度依赖性。通过粘附实验利用共聚焦免疫荧光检测,可发现NRP-2m Ab可抑制乳腺癌细胞的应力纤维的形成,阻碍FAK397位点上酪氨酸自发磷酸化,从而干预乳腺癌细胞的粘附作用。通过Western blotting及普通免疫共沉淀实验,发现NRP-2m Ab阻碍NRP-2与整合素α5β3形成复合物,降低p-FAK、p-smad2/3、MMP-9、Bcl-2蛋白的表达,促进凋亡分子Bax的表达。结论1、NRP-2m Ab能特异性的结合乳腺癌细胞膜上NRP-2蛋白,且在MDA-MB-231细胞上高表达NRP-2。2、NRP-2m Ab能显著抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞的生长,并呈剂量依赖性。3、NRP-2mAb能显著抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞的迁移、侵袭。4、NRP-2m Ab能显著促进MDA-MB-231乳腺癌细胞的发生凋亡。5、NRP-2m Ab能显著抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞的应力纤维的形成,从而影响其粘附作用。6、NRP-2m Ab通过抑制NRP-2与整合素α5β3相互结合从而影响FAK的磷酸化,该发现有助于加深理解NRP-2在细胞粘附及转移过程中的功能。7、NRP-2m Ab通过抑制NRP-2与其受体TGF-β1下调其下游信号通路的磷酸水平,可能直接或间接干预乳腺癌细胞的生长。8、NRP-2m Ab通过抑制NRP-2相关作用分子,下调MMP-9、Bcl-2等分子的表达,上调Bax凋亡分子,可为发现与NRP-2相关作用促进癌细胞迁移侵、凋亡袭等相关分子。