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天然产物(Natural Products,NPs)是药物先导化合物及临床药物的重要来源,其中微生物来源的NPs占比高达1/3。微生物药物发现在上世纪六十年代前后,经历黄金期后,最近几十年却几乎进入停滞状态,人们一度认为微生物药物资源已经枯竭。随着测序技术和生物信息学技术的发展,微生物全基因组被不断揭秘,海量暗物质样沉默基因簇(Biosynthetic Gene Cluster,BGC)被发现。这些暗物质蕴藏了大量的新颖生物活性小分子(Bioactive Small Molecules,BSMs)。通过异源表达激活沉默BGC是获得这些BSMs的主要手段。但克隆获取这些BGC大片段通常比较困难。放线菌作为微生物药物合成的主力,由于其基因组GC含量高的特性,从中直接克隆大片段DNA(≥80kb)目前依旧缺乏简单高效的方法。本研究开发了一种基于CRISPR/Cas12a的简单、快速、直接克隆大片段DNA的体外技术平台,称为CAT-FISHING(CRISPR/Cas12a-mediated fast direct biosynthetic gene clustercloning platform),适用于克隆GC含量高的大片段DNA。本研究首先设计了CAT-FISHING克隆策略,并对CRISPR/Cas12a体外切割DNA大片段的条件进行了考察和优化。随后以大小为137 kb、GC含量达66%的BAC质粒为例,利用CAT-FISHING分别从中成功克隆了50 kb和80 kb的DNA片段,成功率分别达到95%和50%。最后本研究利用BAC文库构建和DNA包埋的方法,利用CAT-FISHING在白色链霉菌J1074基因组中成功克隆到Paulomycin编码基因簇(49 kb,GC含量=71%)和Surugamides编码基因簇(87 kb,GC含量=76%),其克隆阳性率分别为4～5%和2～4%。本研究克隆获得的87 kb BGC也已成功在链霉菌通用底盘中实现了表达。由此可见,该方法不仅实现80 kb以上高GC大片段DNA的克隆,并且具有简单、快速的优势,可以在数天之内完成从任意基因组捕获目标片段克隆,克隆效率相对于经典地通过BAC文库构建获得基因簇的方法提高了近100倍。综上所述,本研究利用CRISPR/Cas12a建立的CAT-FISHING技术不仅可以实现大片段DNA(如BAC质粒)的编辑,还能高效的从任意基因组样品中快速克隆获得目标大片段基因簇。本研究利用CRISPR/Cas12a解决了具有高难度大片段高GC基因簇的高效、快速直接克隆问题并实际应用,展示出了优秀的实战效果。CAT-FISHING作为平台技术,将在基因组挖掘中有巨大的应用潜力并促进微生物来源的新颖活性小分子高效发掘。