研究背景类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种全身性自身免疫病,表现为以双手和腕关节等小关节受累为主的慢性、对称性、持续性多关节炎。RA的病理表现为受累关节滑膜的慢性炎症、继而出现关节软骨和骨破坏,最终可导致关节畸形和功能丧失。自身免疫性炎症引起受累关节局部炎性因子蓄积,进而启动受累关节的炎症反应、导致关节组织的破坏,是RA发生发展的中心环节。关节软骨细胞是关节软骨组织中唯一存在的细胞类型。研究表明RA受累关节中,炎症因子诱导的关节软骨细胞凋亡是关节软骨破坏的始动因素,在RA的发病过程中起到了非常重要的作用。因此,深入研究RA发病过程中关节软骨细胞凋亡的分子机制,有利于进一步揭示RA的发病机制、开拓其防治的新途径,是保护我国有限医疗资源、关系到社会经济发展的重要课题。细胞凋亡的启动是细胞在感受到相应的信号刺激后,胞内一系列控制开关的开启或关闭。不同的外界因素启动凋亡的方式不同,所引起的信号转导也不相同。既往的研究证实:不同的细胞外凋亡诱发因子可通过诱导细胞活性氧生成增加、线粒体功能障碍及内质网应激导致软骨细胞的凋亡。但不同的诱因或不同的细胞系,其调控途径并不完全相同。正常机体代谢会不断产生活性氧类物质(Reactive oxygen species,ROS),主要包括超氧阴离子(O2-)、羟基自由基(-OH)和过氧化氢(H2O2)。机体的抗氧化系统能将多余的ROS转化为对机体无害的物质,进而对其进行新陈代谢。过量的ROS生成会打破体内氧化系统与抗氧化系统的平衡,导致氧化应激状态的发生。研究表明氧化应激在RA的发病以及软骨细胞的凋亡过程中起到了十分重要的作用。此外,氧化应激易引发蛋白质的氧化损伤,导致体内氧化损伤蛋白质的蓄积。晚期氧化蛋白产物(Advanced oxidation protein products,AOPPs)是蛋白质侧链氨基酸遭受氧化损伤后的交联物。既往研究表明,许多氧化应激相关疾病如类风湿性关节炎、尿毒症、糖尿病、炎症性肠病、肥胖症等患者体内的AOPPs水平明显高于正常人,并与疾病严重程度相关。因此,AOPPs是氧化应激的重要标志物。AOPPs不仅是氧化应激的标志物,其本身能诱导机体产生ROS进而形成正反馈,使机体氧化应激状态持续存在。既往研究和本课题组证实AOPPs作为一种新型的炎症介质,本身可促进细胞内活性氧类物质的生成导致氧化应激,在很多慢性炎性疾病的发展过程中起到了十分重要的作用。此外,AOPPs具有细胞毒性作用,可通过不同的细胞机制诱导多种不同类型细胞的凋亡。RA作为一种慢性炎性疾病,患者体内普遍存在AOPPs的蓄积。本课题组的前期研究证实,AOPPs可诱导大鼠关节滑膜样细胞产生炎症应答,可能参与RA的发生发展。但是迄今为止,AOPPs对关节软骨细胞凋亡的影响及其机制尚不清楚。因此有理由假设,AOPPs作为一类内源性致病介质,通过氧化还原相关的途径促进关节软骨细胞凋亡。本课题旨在阐明AOPPs对关节软骨细胞凋亡的作用及其分子机制,为RA的防治提供新的干预靶点。研究方法1、晚期氧化蛋白产物AOPPs的制备大鼠血清白蛋白(Rat serum albumin,RSA),溶于无内毒素的PBS中配制成20mg/ml的溶液。将RSA溶液与40mmol/L的次氯酸钠等体积混合(摩尔比为1:140),室温放置30分钟待其充分反应。将制备完成的AOPPs装入透析袋中,随后将透析袋放至不含内毒素的PBS溶液中4℃透析24h,以去除未反应的次氯酸钠。抽取透析完成的AOPPs溶液,用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。随后用Detoxi-Gel内毒素去除胶,过滤除去溶液中的内毒素。用鲎试剂检测制备完成的AOPPs溶液内的内毒素水平,内毒素水平在0.025EU/ml以下的AOPPs溶液可用于后续实验。将成功制备完成的AOPPs根据实验需求分装,放入-80℃冰箱保存备用,避免溶液反复冻融。用Elasia试剂盒检测溶液中AOPPs的水平。2、大鼠关节软骨细胞培养将4只3周龄的SD大鼠颈椎脱臼法处死后,在严格无菌的条件下,取双侧膝关节及股骨头处关节软骨组织。随后放入盛有含双抗无菌PBS溶液的容器中,仔细清除附着的韧带及骨组织,并用含双抗的无菌PBS溶液反复冲洗三次以上。将冲洗干净的关节软骨组织转移入5ml离心管中,加入1ml浓度为0.25%的胰蛋白酶溶液。使用经高压蒸汽消毒过的眼科剪将软骨组织剪成细小碎块,再加入3ml浓度为0.25%的胰蛋白酶溶液至离心管中。将离心管放入恒温摇箱中,37℃下摇晃消化20分钟。随后以2000的转速离心后弃去上清液,再加入4ml浓度为0.2%的Ⅱ型胶原酶溶液,放入恒温摇箱中,37℃下摇晃消化1h。2000转离心弃去上清液,加入细胞完全培养基,用一次性巴氏吸管反复吹吸软骨组织块悬液。将含有完全培养基的关节软骨组织块悬液,均匀地涂抹在培养瓶内,使得软骨组织块均匀分布于培养瓶内。直立培养瓶,向培养瓶内加入3～4ml完全培养基,翻转放置于细胞培养箱内。24小时后将培养瓶缓慢翻转过来,使完全培养基完全浸没软骨组织块,继续放在培养箱中静置培养。3天后显微镜下观察软骨组织块生长情况,并更换完全培养基。以后每隔2天换液一次,待组织块中原代关节软骨细胞爬出。一般3天左右即有细胞爬出,1周左右时可传代培养。根据实验需要,将原代关节软骨细胞按1:3的比例,接种至细胞培养皿或培养板中(此为第一代细胞)进行后续实验。本实验采用免疫组化和阿利新蓝染色法对第一代关节软骨细胞进行鉴定,发现此方法培养的关节软骨细胞具有很高的纯度并且表型维持良好。因此我们取第一代的细胞,用于后续一系列实验。3、AOPPs诱导关节软骨细胞凋亡将关节软骨细胞接种于六孔板中,待细胞生长至90%左右融合时加入AOPPs刺激。实验前更换不含血清的DMEM,饥饿细胞12小时。用25、50、100、2000μg/ml浓度的AOPPs,200μg/ml未经修饰的RSA以及单纯完全培养基作为对照,刺激细胞24小时。用AnnexinV-FITC/PI双荧光标记流式细胞术及Cell Death Detection ELISA plus试剂盒,检测AOPPs对关节软骨细胞凋亡的的作用。AnnexinV-FITC/PI原理:早期凋亡的细胞可被AnnexinV-FITC标记显示绿色荧光,流式细胞仪凋亡图中显示在Q2象限。晚期凋亡的细胞可被Annexin V-FITC及PI两种荧光同时标记显示红绿两种荧光,流式细胞仪凋亡图中显示在Q4象限。Cell Death Detection ELISA plus试剂盒原理:试剂盒中含特异性抗体,可与细胞凋亡时释放至细胞质中的组蛋白相关的DNA碎裂片段结合。经显色反应后用酶标仪检测,用OD值反映其浓度。将2×104个软骨细胞接种于35mm激光共聚焦培养皿中。随后用200μg/ml的AOPPs、200μg/ml未经修饰的RSA以及单纯完全培养基作为对照,刺激细胞24小时。AnnexinV-FITC/PI双荧光标记细胞后,共聚焦显微镜下观察不同组间细胞凋亡情况。4、AOPPs激活关节软骨细胞内NADPH氧化酶系统及相关受体途径将关节软骨细胞接种于6cm培养皿中,待细胞生长至90%左右融合时加入AOPPs刺激。实验前更换不含血清的DMEM,饥饿细胞12小时。用100μg/ml浓度的AOPPs分别刺激细胞6、12、24及48小时,100μg/ml未经修饰的RSA以及单纯完全培养基培养细胞48小时作为对照。用Western blot法检测不同处理组间NADPH氧化酶亚基p22phox、p47phox、Nox2及Nox4的表达情况。用l00μg/ml浓度的AOPPs分别刺激细胞5、15、30及60分钟,100μg/ml未经修饰的RSA以及单纯完全培养基培养细胞60分钟作为对照。用p22phox及p47phox抗体免疫沉淀各处理组蛋白。检测p47phox磷酸化及p22phox与p47phox、Nox2及Nox4的结合。RAGE受体阻断剂及CD36受体阻断剂预处理细胞2小时,重复上述实验。观察不同受体阻断剂对AOPPs诱导NADPH各亚基表达,47phox磷酸化及p22phox与其它亚基的结合情况。5、AOPPs诱导关节软骨细胞内ROS生成、来源及相关的受体转导途径将关节软骨细胞接种于96孔板中,待细胞生长至90%左右融合时加入AOPPs刺激。实验前更换不含血清的DMEM,饥饿细胞12小时。用25、50、100、200μg/ml浓度的AOPPs,200μg/ml未经修饰的RSA以及单纯完全培养基作为对照,刺激细胞120分钟。用荧光探针二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA),检测不同处理组间细胞内ROS的水平观察浓度效应。浓度为200μg/ml的AOPPs分别刺激关节软骨细胞5、10、20、30、40、50、60、90及120分钟,后检测细胞内ROS水平观察时间效应。用不同的受体阻断剂及不同ROS诱导生成酶系统的阻断剂预处理细胞,再加入200μg/ml的AOPPs刺激细胞60分钟。观察哪些阻断剂可以阻断AOPPs诱导的细胞内ROS水平升高,以判断细胞内ROS的来源及受体信号转导途径。将2×104个软骨细胞接种于35mm激光共聚焦培养皿中。随后用2000μg/ml的AOPPs、2000μg/ml未经修饰的RSA以及单纯完全培养基作为对照,刺激细胞60分钟。DCFH-DA孵育细胞后,共聚焦显微镜下观察不同组间细胞内ROS生成情况。6、AOPPs激活关节软骨细胞内相关凋亡信号调节分子及相关信号转导途径将关节软骨细胞接种于6cm培养皿中,待细胞生长至90%左右融合时加入AOPPs刺激。实验前更换不含血清的DMEM,饥饿细胞12小时。用100μg/ml浓度的AOPPs分别刺激细胞6、12、24及48小时,100μg/ml未经修饰的RSA以及单纯完全培养基培养细胞48小时作为对照。用Western blot法检测不同处理组间凋亡信号蛋白的表达情况。将2×104个软骨细胞接种于35mm激光共聚焦培养皿中。随后用100μg/ml的AOPPs、100μg/ml未经修饰的RSA以及单纯完全培养基作为对照,刺激细胞24小时。JC-1荧光探针孵育细胞后,共聚焦显微镜下观察细胞线粒体膜电位变化情况。用不同的受体阻断剂、ROS诱导生成酶系统的阻断剂及ROS清除剂预处理细胞。再加入l0Oμg/ml的AOPPs刺激细胞48小时。用Western blot法检测不同处理组间凋亡信号蛋白的表达情况,判断活性氧及关节软骨细胞表面受体在凋亡信号激活中的作用。7、阻断不同层面信号转导途径,对AOPPs诱导关节软骨细胞凋亡的影响。用RAGE及CD36受体阻断剂、NADPH氧化酶抑制剂(DPI和apocynin)、ROS清除剂(catalase和SOD)、Caspase抑制剂(Z-VAD-FMK)预处理关节软骨细胞。再加AOPPs刺激,用AnnexinV-FITC/PI双荧光标记流式细胞术及细胞凋亡ELISA试剂盒,检测不同层面信号阻断剂对AOPPs诱导关节软骨细胞凋亡的的影响。8、统计学分析:实验所摄图片为镜下随机获得,CCK8实验重复5次,其余所有实验均重复3次。每个实验指标取这些数据的平均值,以均数±标准差表示所有统计结果应用统计软件SPSS 13.0完成。多个样本均数的比较采用One-Way ANOVA方法,在做两两比较时先计算方差齐性,当方差齐时两两比较采用LSD法,方差不齐时两两比较采用DunnettsT3法;多个样本非参数比较采取多个独立样本非参数检验(K Independent Samples Test),当p<0.05时为具有统计学意义。实验结果:1、AOPPs能诱导关节软骨细胞凋亡流式细胞术示:单纯完全培养基、2000μg/ml未经修饰的RSA及25、50、100、200μg/ml浓度AOPPs组,关节软骨细胞的凋亡率分别为5.4%、4.6%、7.5%、8.2%、9.1%及15.4%。与对照组相比随着AOPPs浓度的增加,关节软骨细胞的凋亡率逐渐升高。激光共聚焦显微镜下观察可见:与对照组相比,镜下绿色荧光标记阳性(代表早期凋亡)与红绿色双荧光标记阳性(代表晚期凋亡)的细胞明显增加。预先加入NADPH氧化酶抑制剂apocynin,可减少AOPPs组凋亡细胞的数量。ELISA结果显示:单纯完全培养基、200μg/ml未经修饰的RSA及25、50、100、2000μg/ml浓度AOPPs组,关节软骨细胞质中组蛋白相关的DNA碎裂片段值分别为0.51、0.49、0.65、0.74、0.72及0.71。与对照组相比AOPPs处理组细胞质中组蛋白相关的DNA碎裂片段明显增多,50μg/ml浓度AOPPs处理组数值最高。单纯完全培养基、50μg/ml未经修饰的RSA及50μg/ml浓度AOPPs刺激12、24、48小时组的组蛋白相关的DNA碎裂片段值分别为0.52、0.49、0.75、0.84及0.94,随刺激时间增加,含量逐渐升高。2、AOPPs通过RAGE而非CD36受体途径,激活关节软骨细胞内NADPH氧化酶系统与对照组相比,AOPPs刺激后p47phox磷酸化水平、p22phox与p47phox、Nox2及Nox4复合物含量在5分钟时即开始增高。说明AOPPs能快速激活关节软骨细胞内NADPH氧化酶系统。此外与对照组相比,AOPPs刺激后Western blot结果显示:NADPH氧化酶各亚基包括p22phox、p47phox、Nox2及Nox4蛋白表达上调,为NADPH氧化酶的持续激活提供了条件。封闭RAGE和CD36重复上述实验结果显示:RAGE受体信号阻断剂(可溶性封闭型RAGE抗体及不含细胞内信号转导结构的可溶性RAGE多肽)能抑制AOPPs对细胞内NADPH氧化酶系统的激活及NADPH氧化酶各亚基蛋白表达的上调,而CD36受体信号阻断剂(可溶性封闭型CD36抗体)不具备此效应。说明AOPPs对关节软骨细胞内NADPH氧化酶系统的激活,主要由RAGE而非CD36受体介导。3、AOPPs通过RAGE受体途径,诱导关节软骨细胞内NADPH氧化酶依赖的ROS生成与对照组相比AOPPs刺激后,细胞内ROS水平在5分钟时即开始增高,并且随着时间的推移其含量不断增高,呈现浓度和时间依赖效应。共聚焦显微镜下观察,进一步证明AOPPs可诱导细胞内ROS水平增高。此外用NADPH氧化酶抑制剂apocynin预处理细胞,可极大的降低AOPPs诱导的细胞内ROS生成。为进一步阐明细胞内ROS的来源,用不同ROS诱导生成酶系统的阻断剂预处理细胞。结果显示ROS清除剂(SOD和catalase)、NADPH氧化酶抑制剂(apocynin和DPI)可极大的降低AOPPs诱导的细胞内ROS生成;而线粒体呼吸链抑制剂(retenone和TIFA)及一氧化氮合酶抑制剂L-NAME不具备此效应。最后为证实AOPPs诱导细胞内ROS生成的受体信号来源,AOPPs刺激前用可溶性封闭型RAGE抗体、可溶性RAGE多肽及可溶性封闭型CD36抗体预处理细胞。结果显示:阻断RAGE受体能较大程度的阻断AOPPs诱导的ROS生成,而阻断CD36受体不具备此效应。说明AOPPs诱导关节软骨细胞内ROS生成的信号,由RAGE受体转导。4、AOPPs刺激触发关节软骨细胞内源性凋亡通路的激活内源性凋亡通路主要由线粒体功能障碍及内质网应激介导。在AOPPs的刺激下Western blot结果显示:线粒体凋亡通路中的促凋亡分子Bax、Cytochrome C表达上调,而抗凋亡分子Bcl-2表达下调;内质网凋亡通路中的促凋亡分子Chop及Cleaved caspase-12表达上调;它们下游共同的促凋亡分子Cleaved caspase-9及Cleaved caspase-3水平上调,而具备受损DNA修复功能的抗凋亡分子PARP水平下调。激光共聚焦显微镜下观察:AOPPs刺激可导致细胞线粒体膜电位水平的下降。预先孵育NADPH氧化酶抑制剂apocynin,可较大程度的逆转AOPPs所致的线粒体膜电位水平下降。上述实验证明AOPPs可激活,由线粒体功能障碍及内质网应激介导的内源性凋亡通路。5、AOPPs对关节软骨细胞内源性凋亡通路的激活由RAGE受体及NADPH来源的ROS介导为阐明AOPPs触发的内源性凋亡通路的受体信号转导途径。在AOPPs刺激前用可溶性封闭型RAGE抗体、可溶性RAGE多肽及可溶性封闭型CD36抗体预处理细胞。Western blot结果显示:封闭RAGE受体可逆转AOPPs诱导的内源性凋亡通路中促凋亡分子Bax、Cytochrome C、Chop、Cleaved caspase-12、Cleaved caspase-9及Cleaved caspase-3水平的上调;同时可逆转AOPPs诱导的内源性凋亡通路中抗凋亡分子Bcl-2和PARP的下调;而封闭CD36受体不具备此效应。说明AOPPs触发的内源性凋亡通路激活,受RAGE受体调控。为阐明NADPH来源的ROS,是否为AOPPs触发的内源性凋亡通路的上游信号分子。在AOPPs刺激前,预先加入ROS清除剂(SOD和catalase)及NADPH氧化酶抑制剂(apocynin 和 DPI)。Western blot 结果显示:预先加入 SOD、catalase、apocynin和DPI,可较大程度的抑制AOPPs对内源性凋亡通路的激活。说明NADPH来源的ROS,为AOPPs激活的内源性凋亡通路中的上游信号分子。6、RAGE受体封闭、抑制NADPH氧化酶、清除细胞内ROS及抑制Caspase可逆转AOPPs诱导的关节软骨细胞凋亡为验证阻断不同层面的信号转导,对AOPPs诱导关节软骨细胞凋亡作用的影响。在AOPPs刺激前用可溶性封闭型RAGE抗体、可溶性RAGE多肽、可溶性封闭型CD36抗体、NADPH氧化酶抑制剂apocynin、ROS清除剂SOD和Caspase抑制剂Z-VAD-FMK预处理细胞。AnnexinV-FITC/PI双荧光标记流式细胞术及Cell Death Detection ELISA结果显示:封闭RAGE受体、抑制NADPH氧化酶、清除细胞内ROS及抑制Caspase,可逆转AOPPs诱导的软骨细胞凋亡及胞质中组蛋白相关的DNA碎裂片段的升高;而封闭CD36受体不具备此效应。结论本实验在体外证明了:AOPPs可激活关节软骨细胞内源性凋亡通路,进而诱导细胞凋亡;NADPH来源的ROS是该效应重要的上游信号分子;该效应一系列信号通路的激活由RAGE受体转导。这些实验现象提示:在RA患者体内蓄积的新型致炎因子AOPPs。可通过RAGE受体,激活NADPH氧化酶,触发细胞内ROS生成,通过氧化还原敏感的内源性凋亡信号通路诱导关节软骨细胞凋亡,进而参与了 RA的发生发展。针对AOPPs病理生物学效应的阻断方式,可能为防治RA提供新的治疗思路。