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睾丸特异性蛋白酶50(Testes-specific protease 50,TSP50)是一种苏氨酸蛋白酶,在肿瘤的发生和发展中扮演重要角色。以往人们对TSP50的研究主要集中于其对细胞增殖和转移等细胞生物学特性的影响,而关于TSP50在上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)发生发展中的作用研究尚未见报道。本研究主要探讨了TSP50在EMT中的作用,并对其机制进行了初步研究。1.不同细胞系中TSP50和EMT标志物的表达分析为了确定TSP50对EMT的影响,我们首先利用RT-PCR和Western blot方法分析了不同细胞系中TSP50和EMT相关标志物的表达情况。结果发现,在高表达TSP50的细胞中EMT间质标志物Vimentin的表达量亦较高,而上皮标志物E-cadherin的表达则较低;但是在低表达TSP50的细胞中EMT相关标志物的表达量则正好相反。此结果提示,TSP50和EMT可能呈正相关。2.TSP50和EMT的相关性研究(1)过表达TSP50对EMT标志物表达的影响为了验证我们的假设,我们通过过表达或敲低TSP50表达的方法探讨了TSP50的表达量与EMT之间的相关性。我们首先在低表达TSP50的MCF-10A细胞中过表达TSP50,利用Western blot实验分析了过表达TSP50对细胞EMT相关标志物表达的影响。结果显示,过表达TSP50可以使细胞中EMT间质表型标志物N-cadherin和Vimentin的表达上调,EMT上皮表型标志物E-cadherin的表达下调。为了探讨TSP50对EMT的影响是否具有剂量依赖效应,我们在内源高表达TSP50的MDA-MB-231细胞中的进一步过表达TSP50,之后检测EMT标志物的表达情况。结果显示,随着TSP50的表达增高,EMT间质表型标志物N-cadherin和Vimentin的表达进一步上调,EMT上皮表型标志物E-cadherin的表达则进一步下调。以上结果提示,TSP50可促进EMT,且此促进作用具有TSP50表达量依赖性。(2)敲低TSP50的表达对EMT标志物表达的影响为了进一步证实以上结果,我们在高表达TSP50的MDA-MB-231细胞中通过RNAi方法敲低TSP50的表达,之后利用Western blot方法分析了EMT相关标志物的表达情况。结果显示,敲低TSP50的表达可以使细胞中EMT间质标志物N-cadherin和Vimentin的表达下调,EMT上皮标志物E-cadherin的表达上调。此结果进一步证明了TSP50对EMT的促进作用。(3)TSP50对细胞侵袭性的影响细胞发生EMT后会具有一定的侵袭性,因此我们探讨了TSP50对细胞侵袭性的影响。Transwell实验结果显示,过表达TSP50可以增强细胞的侵袭能力,反之敲低TSP50则会抑制细胞的侵袭能力。综上所述,我们发现TSP50的表达量与EMT的发生呈正相关。3.TSP50促进EMT的机制研究为了探究TSP50影响EMT的分子机制。我们通过过表达或敲低TSP50表达的方法探讨了TSP50对细胞内信号通路的影响。Western blot结果显示,过表达TSP50后磷酸化的IKK和IκB的水平上升,p65的入核增加;同时磷酸化的AKT和ERK1/ERK2水平亦明显增加;但是Smad2/3的入核则明显降低。敲低细胞中TSP50的表达则Smad2/3的入核明显增加,而磷酸化的AKT和ERK1/2水平则明显降低。以上结果说明,TSP50可以激活NF-kB、AKT及ERK/MAPK信号,同时抑制TGF-β信号。为了进一步探讨这些信号与TSP50所诱导的EMT的相关性,我们在过表达TSP50的细胞中利用抑制剂分别阻断了NF-kB、ERK/MAPK及AKT信号,之后检测了EMT相关标志物的表达变化。结果显示,抑制NF-kB、AKT及ERK/MAPK信号均可抑制由过表达TSP50所诱导的EMT。我们又在过表达TSP50的细胞中过表Smad2/3,之后检测了EMT相关标志物的表达变化。结果显示,过表达Smad可以抑制由过表达TSP50所诱导的EMT。以上结果提示,NF-kB、AKT、ERK/MAPK和TGF-β信号均参与了TSP50所诱导的EMT。4.TGF-β与TSP50在诱导EMT过程中的相互作用研究因为在之前的报道中,TGF-β可以刺激乳腺上皮细胞发生EMT,而我们的研究则显示,TSP50可以抑制TGF-β信号,但可诱导EMT,这些矛盾的结果促使我们进一步探讨了TGF信号与TSP50所诱导的EMT之间的相关性。我们用TGF-β刺激过表达TSP50的细胞,发现长时间的刺激会引起由TSP50诱导的EMT细胞发生间质上皮转化(Mesenchymal-epithelial transition,MET)。同时,我们还发现,TGF-β在抑制TSP50所诱导的EMT的同时,也抑制了AKT和ERK的激活。此结果提示,TSP50和TGF-β在调控细胞发生EMT的过程中存在着复杂的信号调控网络。本研究证实了原癌基因TSP50可以诱导EMT的发生,并从细胞内信号角度初步探讨了TSP50促进EMT的分子机制以及TGF-β与TSP50在EMT发生过程中的复杂作用关系,从而为全面阐明原癌基因TSP50在肿瘤发生及发展中的作用及机制奠定实验基础。