背景与目的：急性髓细胞白血病(AML)是成年人常见的血液系统恶性肿瘤之一,目前白血病的治疗仍以化疗为主。尽管联合化疗已明显延长了患者的生存期,但白血病细胞多药耐药(multidrug resistance, MDR)仍为当今血液肿瘤治疗中的一大难题。近来研究认为多通道多靶点信号传导通路异常,细胞信号网络调控失衡,导致细胞增殖失控、凋亡受阻,是白血病细胞耐药的重要机制。当前应用单一细胞信号传导通路抑制剂如Bortezomib、RAD001、LBH589和三氧化二砷等抗肿瘤效果差,而有限的初步研究结果显示联合多靶点信号传导通路抑制剂能够增强抗肿瘤活性,提高细胞对化疗药物的反应性。但是,用于耐药的急性髓系白血病方面研究极少,联合上述药物逆转白血病细胞耐药及探索优化组合方案的研究报道缺乏。HL-60/ADM细胞是公认的急性髓系白血病多药耐药细胞株,我们前期研究证明Bortezomib联合三氧化二砷可以协同逆转HL-60/ADM和难治性AML原代细胞耐药,增强化疗的敏感性。蛋白酶体抑制剂硼替佐米(Bortezomib, Velcade,万珂)可以特异性抑制NF-κB通路蛋白的磷酸化,降低抗凋亡蛋白的活性,具有靶向抗肿瘤效应。体内外研究证明Bortezomib对淋巴瘤、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞均有较好的抗肿瘤效应,还可以克服传统化疗药物的耐药性。RAD001(Everolimus)是新合成的雷帕霉素衍生物,通过抑制mTOR的活性,阻断P I3K/Akt/mTOR信号通路,诱导细胞凋亡。有研究表明,RAD001与细胞毒性药物或P13K抑制剂或组蛋白去乙酰化酶抑制剂MS-275联合,可以协同抑制HL-60、Jarket等白血病细胞增殖作用和促进凋亡作用。LBH589是第二代高活性的组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDAC inhibitors, HDACIs),在骨髓瘤细胞中研究表明LBH589可以调节Bcl-2、Bax等多种凋亡蛋白的表达,诱导细胞凋亡,还可以提高马法兰、Bortezomib等药物的抗肿瘤治疗效果。在T细胞白血病／淋巴瘤中的研究发现,组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA联合Bortezomib作用于细胞信号通路中Akt、NF-kB、JNK、p38MAPK等多个靶点,可以协同诱导caspase介导的细胞凋亡。有研究报道,LBH589联合Akt抑制剂AEE788可以抑制MEK、Akt蛋白磷酸化,可以协同诱导K562、Jurkat和ML-1白血病细胞凋亡。2008年ASH会议上Mamta Gupta等报道,在弥漫大B细胞淋巴瘤中LBH589与雷帕霉素联用也有协同抗肿瘤效果。但在耐药性AML细胞中联合多靶点信号通路抑制剂诱导细胞凋亡、逆转耐药的报道极少。本课题拟研究联合Bortezomib、RAD001、LBH589抑制急性髓系白血病多药耐药细胞株HL-60/ADM增殖,诱导凋亡及逆转耐药作用,旨在优化分子靶向药物逆转AML耐药的最佳组合方案并探讨其机制,随后通过难治性AML原代细胞验证,为难治性白血病治疗探索一条新途径。研究方法：首先选择急性髓系白血病多药耐药细胞株HL60/ADM为研究对象。应用MTT法计算增值抑制率,以24h阿霉素ICso值比较HL-60/ADM和HL-60细胞对阿霉素的敏感性,以耐药倍数大于30倍定义为耐药。此后将HL60/ADM细胞于含有10%小牛血清的RPMI-1640培养基中进行培养,以不同浓度药物处理HL60/ADM细胞12-72h,观察时间-剂量依赖性增殖抑制效应,在0-50nM之间确定LBH589 48h IC50浓度,在0-30nM之间确定Bortezomib 48h IC50浓度,在0-30μM之间确定RAD001 48h IC50浓度。确定LBH589 48h IC50浓度约为28nM, Bortezomib 48h IC50浓度为16nM, RAD001 48h IC50浓度为12μM。将HL-60/ADM细胞分为LBH589、RAD001、Bortezomib单药处理组、LBH589联合RAD001处理组和LBH589联合Bortezomib处理组,每组处理的细胞数一致,每组均设置空白对照组。各组检测指标相同,即用MTT法检测细胞增殖、AnnexinV-FITC/PI和Hoechst33342染色检测细胞凋亡,并应用流式细胞仪检测HL-60/ADM细胞MRP1表达和摄取阿霉素的情况。根据各组增殖抑制率,利用Calcusyn软件计算药物协同指数(CI)确定优化组合方案。选择难治性AML患者原代细胞,以优化组合方案处理细胞,MTT测定其增殖抑制率,验证其在原代细胞中的有效性。利用优化方案处理HL60/ADM细胞,分别提取细胞总蛋白和核蛋白,Western Blot检测PI3K/Akt/NF-κB信号通路及凋亡蛋白水平变化。对Western印迹胶片用Gel-Pro Analyzer软件进行光密度扫描定量分析,用目的蛋白和β-actin的积分光密度值(IOD)的比值来反映蛋白的相对表达水平,探讨联合多靶点信号传导抑制剂逆转白血病细胞耐药的分子机制。利用SPSS13.0软件进行统计学分析。不同浓度RAD001增殖活性差异采用单因素方差分析。依据LBH589、RAD001、Bortezomib单药或联合对HL60/ADM细胞增殖活性影响,利用Calcusyn软件计算药物协同作用指数(CI),反映药物之间的相互作用效果。判定标准：CI＜1,反映药物之间为协同作用；CI=1,反映药物之间为相加作用；CI＞1,反映药物之间为拮抗作用。采用方差分析比较不同处理组细胞凋亡率,两两比较采用LSD法；多样本采用方差分析；对原代细胞的细胞活性差异采用随机区组方差分析,两两比较采用LSD法检验；不同处理组蛋白相对表达水平的比较,采用单因素方差分析。结果：1. HL60/ADM细胞的耐药性确定MTT法检测HL60/ADM细胞阿霉素敏感性显示：阿霉素作用于HL60/ADM细胞的IC50值约为6.833μg/ml,作用于HL60细胞的IC50值仅为0.086μg/ml, HL60/ADM细胞耐药倍数为HL60的79倍,说明HL60/ADM细胞对阿霉素高度耐药,可以作为下一步研究对象。2.RAD001或联合LBH589对HL60/ADM细胞增殖、凋亡及耐药的影响MTT法检测细胞增殖活力显示：不同浓度RAD001对HL60/ADM细胞均具有生长抑制作用,随时间延长和剂量增加增值抑制率也逐渐提高,呈明显的时间一剂量依赖关系。不同浓度RAD001作用于HL60/ADM细胞48h和72h,30μmol/L药物浓度均达到最大抑制效果,增加药物浓度至40或50μmol/L时细胞增殖抑制率之间差异无显著意义,P>0.05。RAD001和LBH589对HL60/ADM细胞48hIC50值分别为12μmol/L和28nmol/L。以两药1/2IC50、3/4IC50、IC50、1.5IC50、2IC50浓度联合作用于耐药HL60/ADM细胞48h,1/2 IC50、3/4 IC50、IC50联合组细胞增殖抑制率高于各单药组,P<0.05。但1.5IC50、2IC50联合组增殖抑制率与RAD001单药组相比变化不明显,P>0.05。利用Calcusyn软件计算药物协同指数(CI),不同浓度RAD001联合LBH589时CI值均大于或等于1,说明两药联合没有协同抑制HL60/ADM细胞增殖的作用。AnnexinV-FITC/PI双染法流式细胞仪检测细胞凋亡显示：对照组HL60/ADM细胞凋亡率为5.13±0.7%,5μmol/L、10μmol/L和20μmol/L RAD001处理组细胞凋亡率分别为17.6±1.58%、48.3±5.74%和78.5±8.71%。可见随着药物浓度的增加,细胞凋亡率也随之增加(P<0.05)。Hoechst33342染色形态学观察凋亡显示：空白对照组细胞几乎无凋亡现象,不同浓度RAD001处理HL60/ADM细胞48h均可见凋亡小体,表现为核固缩、凝集,明亮的颗粒状蓝染,并且也随着RAD001浓度增加,凋亡细胞也逐渐增多。流式细胞仪检测细胞MRP1蛋白表达结果显示：HL-60/ADM细胞MRP1阳性率为92.9±3.54%,与HL-60细胞(1.87±0.09%)相比差异显著,P<0.01,提示耐药性AML细胞株HL-60/ADM高表达MRP1。10μmol/L RAD001处理HL-60/ADM细胞24h后,MRP1阳性率为79.10±3.88%,显著低于对照组,P<0.01。10μmol/L RAD001处理HL-60/ADM细胞24h后,加入终浓度为0.5μg/ml阿霉素,流式细胞仪检测细胞阿霉素摄取率结果显示：RAD001处理组为15.36±1.5%,明显高于对照组(8.53±0.74%),P<0.01,提示RAD001可以提高HL-60/ADM细胞阿霉素摄取率。以上结果提示,RAD001处理HL-60/ADM细胞能够下调MRP1的表达,提高阿霉素摄取率,逆转耐药。3.LBH589联合Bortezomib对HL60/ADM细胞增值、凋亡的影响MTT法检测细胞增殖抑制率结果显示：LBH589和Bortezomib对HL60/ADM抑制效应显示出剂量依赖性,即随药物剂量增加增殖抑制作用显著增强。LBH589. Bortezomib单药对HL60/ADM细胞48h IC50值分别为28nmol/L和16nmol/L,以HL60/ADM细胞1/2 IC50、3/4 IC50、IC50、3/2 IC50、2 IC50浓度LBH589、Bortezomib单药或联合作用于HL60/ADM细胞48h,各浓度联合组增值抑制率均高于单药组,P值均<0.05,利用Calcusyn软件计算药物协同作用指数。不同浓度LBH589联合Bortezomib时CI值均小于1,说明具有协同抑制增殖作用,其中21nmol/L LBH589联合12nmol/L Bortezomib协同作用最为明显,CI值为0.531。AnnexinV-FITC/PI双染法流式细胞仪检测凋亡显示：21nmol/L LBH589、12nmol/L Bortezomib单药或联合处理HL60/ADM细胞48h。对照组细胞凋亡率为5.36±0.47%,而LBH589和Bortezomib单药处理后凋亡率分别为45.6±5.56%,39.4±4.38%,显著高于对照组(P<0.01),但单药组之间没有统计学差异(P>0.05)。而两药联合处理后细胞凋亡率进一步提高至76.8±9.64%,与单药组之间差异显著,P<0.01。Hoechst33342染色形态学观察凋亡显示：空白对照组细胞几乎无凋亡现象,而LBH589、Bortezomib单药组和联合组处理细胞48h均可见凋亡小体,并且在对照组、单药组、联合组中凋亡细胞依秩增多。4.LBH589联合Bortezomib对HL60/ADM细胞耐药的影响及机制研究流式细胞仪检测细胞MRP1表达结果显示：21nmol/L LBH589、12nmol/L Bortezomib单药处理HL-60/ADM细胞24h,其MRP1阳性率分别为76.06±4.94%和71.84±5.54%,均低于对照组,P<0.05。当上述浓度LBH589和Bortezomib联合时可以进一步降低MRP1的表达,其阳性率为57.78±3.48%,P<0.05。流式细胞仪检测细胞阿霉素摄取率结果显示：21nmol/L LBH589和12nmol/L Bortezomib联合处理组阿霉素摄取率为64.81±3.31%,高于LBH589(28.96±2.37%)和Bortezomib (37.26±3.66%)单药组,P<0.01,而单药组与对照组(8.53±0.74%)之间也存在显著性差异,P<0.01。以上结果提示,LBH589、Bortezomib单药或联合处理HL-60/ADM细胞能够下调MRP1的表达,提高细胞阿霉素摄取率,逆转耐药,而两药联合时效果更加明显。Western blotting检测HL-60/ADM细胞的蛋白水平变化结果显示：LBH589单药处理HL-60/ADM细胞24h和48h Acetyl-Histone3表达高于对照组,当与Bortezomib联合处理时可以进一步提高细胞Acetyl-Histone3的表达水平,P<0.05,但Histone3总蛋白表达水平保持不变。分析P53蛋白的结果显示,LBH589、Bortezomib联合处理24h或单药处理48h P53蛋白表达均高于对照组,P<0.01,而联合处理48h后P53蛋白水平进一步升高。研究抗凋亡蛋白Bcl-2和XIAP结果发现,LBH589、Bortezomib两药联合处理细胞24h和48h可以降低Bcl-2和XIAP的表达水平。与凋亡相关的Caspase和PARP蛋白在LBH589、Bortezomib单药作用HL-60/ADM细胞24h可以诱导细胞Caspase-8、3和PARP蛋白的裂解激活,产生裂解片段,延长时间至48h或两药联合时可以进一步提高活化作用,P<0.05。研究PI3K/Akt/NF-KB信号传导通路中蛋白变化结果显示：LBH589、Bortezomib单药或两药联合处理后总AKT蛋白和总IKKα蛋白水平保持不变。但单药处理细胞48h,可以抑制磷酸化AKT蛋白(p-AKT)、磷酸化IKKα/β蛋白(p-IKKα/β)的表达,当两药联合时效果更加明显,P<0.05。研究核转录因子NF-κB P65结果表明：LBH589、Bortezomib单药处理24h或48h,细胞核蛋白NF-κB P65蛋白水平较对照组减低,P<0.05,而两药联合处理可以进一步抑制其表达。以上结果提示LBH589和Bortezomib联合处理HL-60/ADM细胞可以明显降低PI3K/Akt/NF-κB信号传导通路活性,上调P53蛋白的表达,抑制Bcl-2和XIAP蛋白表达,促进Caspase-3、8和PARP的裂解激活,诱导细胞凋亡。5.LBH589联合Bortezomib对难治性急性髓系白血病原代细胞增殖的影响MTT法检测原代细胞增殖抑制率结果显示：LBH589和Bortezomib对难治性AML原代细胞抑制效应均显示出剂量依赖性,但原代细胞对不同浓度药物的敏感性均低于细胞株,P<0.01。LBH589、Bortezomib对HL60/ADM细胞48hIC5o值分别为28nmol/L和16nmol/L,以两药HL60/ADM细胞1/2 IC50、3/4 IC50、IC50、3/2 IC50、2 IC50浓度联合作用于难治性AML原代细胞48h,各浓度联合结果均高于单药组,P值均<0.05。利用Calcusyn软件计算药物协同指数,不同浓度药物联合时CI值均小于1,说明均有协同抑制增殖作用。其中,21nmol/L LBH589和12nmol/L Bortezomib联合对原代细胞增殖抑制率协同作用也最为明显,CI值为0.498。与HL60/ADM细胞株相比,不同浓度药物对耐药AML原代细胞敏感性均低于HL60/ADM细胞株。研究结果表明LBH589联合Bortezomib可以协同抑制难治性AML原代细胞增殖,但其抑制率低于HL60/ADM细胞。结论：1、LBH589、RAD001单药对耐药AML细胞具有抑制增殖及诱导凋亡作用,其抑制作用效果随着时间和剂量的增加而增强。2、不同浓度LBH589、RAD001联合作用于HL-60/ADM细胞,协同作用指数(CI)均大于或等于1.0,表示两种药物联合时没有协同抑制增殖作用。3、不同浓度LBH589、Bortezomib联合作用于HL-60/ADM细胞和难治性AML原代细胞,CI值均小于1,说明两药联合具有协同抑制增殖及诱导凋亡作用,其中21nmol/L LBH589和12nmol/L Bortezomib联合时协同作用最为明显。4、LBH589、Bortezomib能够明显下调HL-60/ADM细胞MRP1的表达,提高细胞阿霉素摄取率,逆转耐药,而两药联合效果更加明显。5、LBH589联合Bortezomib处理HL-60/ADM细胞,可以降低PI3K/Akt/NF-κB信号通路活性,上调P53蛋白的表达,抑制Bcl-2和XIAP蛋白表达,促进Caspase-3、8和PARP的裂解激活,共同参与逆转AML耐药。