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癌症已经成为危害人类生命健康的重大疾病之一,尤其对于亚洲人群而言,肝癌HCC的预防与治疗尤为重要。DOX作为肝癌治疗的临床一线药物,因其极易出现耐药性、剂量依赖性疗效和强的毒副作用,已经无法满足HCC患者治疗的需求,因此寻求新的分子靶向药物与合理的药物联合治疗方案设计成为肝癌治疗新的发展方向。FoxM1是一类高表达于各种肿瘤组织的,广泛参与肿瘤发生发展的转录激活因子,被誉为“癌症的致命伤”,是开发癌症治疗药物的极具潜力的重要靶点之一。P201是本实验室前期通过噬菌体展示技术,以FoxM1-DBD为直接靶点从成熟的噬菌体随机十二肽库中筛选得到的分子靶向多肽,前期实验发现简单修饰后的多肽9R-P201对肝癌细胞具有较强的抑制作用。本课题以肝癌细胞HepG2-C3A为主要研究对象,以降低DOX用药剂量和耐药性为主要目的,首先通过体外细胞增殖抑制率实验发现:9R-P201、DOX都可抑制肝癌HepG2-C3A细胞的增殖,其中DOX对肝癌细胞HepG2-C3A的增殖抑制率表现为剂量和时间依赖关系;分别设计联用浓度及作用时间梯度研究,结果发现9R-P201与DOX最佳联用方案为先加入9R-P201(60.0μg/mL)处理12小时,后加DOX(0.2μg/mL)共同处理24h,共36h。其次运用AO/EB双染、流式细胞仪凋亡检测、qRT-PCR、Western blot等分子生物学手段证实:与DOX单独用药组相比,9R-P201与DOX联合处理组可明显促进肝癌HepG2-C3A细胞凋亡,并通过下调FoxM1的表达,从而下调MDR1、ABCG2等耐药相关蛋白质的表达,使得HepG2-C3A细胞对DOX的耐药性降低。为进一步研究FoxM1的调控作用,我们通过慢病毒转染技术构建过表达FoxM1-c的稳定细胞株。其中重组载体测序所得序列信息与NCBI数据库序列比对结果为PCR扩增序列仅有三个同义突变点,其他均保持一致;293T慢病毒包装实验浓缩收集的病毒液经倍比稀释法测定滴度为:5.6×10~8 TU/mL;后转染HepG2-C3A细胞,经过嘌呤霉素筛选,与荧光显微镜下观察有绿色荧光,成功获得稳定过表达FoxM1-c的HepG2-C3A细胞株。为获得较P201具有更高抑癌效果的小分子靶向多肽,最后研究以重组表达的FoxM1-DBDp为靶标,通过四轮生物淘选,从噬菌体随机十二肽库中筛选获得了15条多肽序列;反筛测定发现有5条多肽序列P/N值较高,DS3.0分子动力学对接模拟发现:P15序列与FoxM1-DBD具有最低的结合自由能,具有进一步的研究价值。综上所述,9R-P201与DOX联合作用可以明显增强DOX对肝癌HepG2-C3A细胞的促凋亡作用,并通过下调FoxM1的表达使得MDR1、ABCG2等耐药相关蛋白的表达下调,从而使HepG2-C3A细胞对DOX的耐药性降低,表明9R-P201与DOX联合用药在肝癌优化治疗研究领域具有巨大的潜力;同时设计完成了过表达FoxM1-c的HepG2-C3A细胞株,为进一步深入研究奠定基础,最后以FoxM1-DBDp DNA结合结构域目的蛋白为靶标,从噬菌体随机十二肽库中筛选获得了15条多肽序列,为寻找更强疗效的分子靶向多肽提供重要的前期工作基础。