棉铃虫Helicoverpa armigera(Hubner)隶属于鳞翅目夜蛾科棉铃虫属,是全球范围内危害最严重的棉花害虫。为应对棉铃虫对化学杀虫剂抗性的迅速发展,上世纪90年代后期转Bt基因抗虫棉开始在世界范围内推广种植,到2016年,全球转Bt棉花种植面积已达1500万公顷。Bt棉的种植有效控制了靶标害虫棉铃虫和棉红铃虫的危害,降低了棉花的生产成本,提高了棉花产量,产生了巨大的生态和经济效益。为了避免棉铃虫对化学杀虫剂抗性快速演化问题的再次上演,在1996年第一代单价Bt-Cry1Ac抗虫作物商业化种植开始就执行了严格的高剂量/庇护所(high-dose/refuge)抗性治理策略。随后,为了克服单价Bt作物防治靶标害虫种类有限、庇护所面积过大等问题及延缓靶标害虫抗性产生,2003年转入Cry1Ac和Cry2Ab基因的第二代Bt棉花开始在美国和澳大利亚推广,标志着基因聚合(gene pyramiding)或基因叠加(gene stacking)抗性治理策略的应用。我国于1997年开始一直种植转Bt-Cry1Ac基因抗虫棉,采用自然庇护所的抗性治理策略。2010年的监测结果表明,北方棉区部分棉铃虫种群对Cry1Ac毒素产生了早期抗性,对Cry2Ab毒素的敏感性还没有显著影响。但最新监测结果显示,田间种群棉铃虫Cry1Ac抗性个体频率及田间非隐性抗性基因频率较2010年均有显著上升,棉铃虫对Cry1Ac抗性的这一变化是否会对Cry2Ab毒素的敏感性产生影响?本文通过对Cry2Ab毒素4年的敏感性监测、对室内筛选Cry2Ab抗性品系的遗传特性、交互抗性及其在不同品种棉花的存活实验评估了我国棉铃虫对Cry1Ac+Cry2Ab双价棉的抗性风险,同时对有关基因叠加抗性治理策略成功应用的相关条件进行了论证。虽然双价Bt棉花的田间种植已经近十年,但靶标害虫对Cry2Ab抗性研究远远落后于Cry1Ac抗性研究。澳大利亚棉铃虫Cry2Ab隐性抗性是由ABCA2基因突变导致丧失Cry2Ab毒素结合能力引起的。那么我国棉铃虫对Cry2Ab的抗性机理如何?本文运用pull-down和液相-二级质谱联用技术分离和鉴定了棉铃虫中肠Cry2A毒素结合蛋白,并验证了是否与抗性相关;通过构建遗传分离群体,采用QTL定位和转录组测序定位和筛选疑似抗性基因;最后通过信号通路相关抑制剂的生物测定和CRISPR/dCas干扰技术对相关基因进行了功能验证。上述工作的研究结果,对当前和今后如何有效开展我国转基因抗虫棉的种植,以有效控制抗性棉铃虫的发生和危害具有重要指导意义;同时发现中国棉铃虫对Cry2Ab显性抗性可能与GPCR/G蛋白信号通路相关,表明棉铃虫对Cry2Ab的抗性机理存在多样性。具体结果如下:1.棉铃虫田间种群Cry2Ab毒素的敏感性调查采用浓度对数-死亡机率值法,在2013-2016年连续四年调查了我国新疆棉区(沙湾)、华北棉区(安阳、开封、安次、高阳、南皮、邱县、惠民、夏津)以及长江流域棉区(荆州、望江、盐城)等12个田间种群棉铃虫对Cry2Ab毒素的敏感性,结果表明各地田间种群对Cry2Ab毒素的敏感性差异均在10倍以内。比较每年度转基因棉种植密集的华北和长江流域棉区11个种群LC50平均值与室内敏感品系An和未种植Bt棉新疆沙湾种群LC50平均值,4年间Cry2Ab敏感性差异为2.0-2.7倍。2016年采用诊断剂量法,检测了各田间种群对Cry2Ab的抗性个体频率。转基因棉种植区11个棉铃虫种群Cry2Ab诊断剂量存活率在1.4%-5.2%之间,平均存活率3.3%(106/3168),显著高于沙湾种群(3/288,1.0%)和室内敏感品系An(0/288,0),转基因棉种植区和未种植区之间Cry2Ab抗性个体频率存在显著差异(χ2=13.7,df=1,P = 0.025)。Spearman相关性分析显示各检测种群抗性个体频率与LC50值呈正相关(rs = 0.74,df=12,P = 0.0001),两种监测方法结果具有一致性。以上结果表明,在我国转单价棉长期种植引起棉铃虫对Cry1Ac抗性频率的升高可能会影响对Cry2Ab毒素的敏感性,因此我国对转Cry1Ac和Cry2Ab基因双价棉的选择应持谨慎态度。2.棉铃虫Cry2Ab抗性品系筛选及适合度研究2009年,通过F2筛选获得了几个棉铃虫携带Cry2Ab抗性基因的单雌系,混合后用Cry2Ab毒素连续筛选37代建立了抗性品系An2Ab。生物测定结果显示与未筛选对照品系An相比,An2Ab对Cry2Ab具有130倍的抗性,对Cry2Aa毒素具有81倍的高水平交互抗性,对Cry1A类毒素具有18-22倍的交互抗性。抗性遗传方式研究结果显示对Cry2Ab抗性接近于完全显性、常染色体遗传。通过不同模型比较回交后代在不同浓度下实际死亡率与期望死亡率的差异性,表明An2Ab品系中与Cry2Ab抗性相关位点数量在2-5个之间。用不同品种棉花的叶、蕾、铃分别喂食An和An2Ab品系棉铃虫初孵幼虫至化蛹,An2Ab在单价抗虫棉Bollgard I(5.3%± 1.3%)、GK19(6.7%±0.7%)和双价抗虫棉Bollgard 11(4.0%±2.0%)上的存活率显著高于敏感品系An(均为0)。但取食非Bt棉泗棉3号,An2Ab品系存活率(23.3%±3.3%)与敏感品系An(30%±5.8%)相比没有显著差异,表明棉铃虫对Cry2Ab抗性不存在适合度代价。An2Ab对Cry2Ab的抗性为显性遗传、与Cry1A类毒素有明显的交互抗性、能够在Bt棉上存活以及不存在适合度代价,这些特性表明双价抗虫棉的饱和杀死(redundant killing)策略对Cry2Ab抗性棉铃虫不能实现完全的控制。因此,在我国如果想单纯依靠推广应用双价Bt基因抗虫棉延缓棉铃虫的抗性可能不会起到很好的作用,必须考虑在转基因抗虫棉中增加其它因子才能实现更好地抗性治理。3.棉铃虫Cry2A毒素中肠结合蛋白的鉴定及分析利用Pull-down技术富集棉铃虫中肠Cry2A毒素结合蛋白,液相-二级质谱联用(LC-MS/MS)技术鉴定结果显示主要结合蛋白包括:钙粘蛋白类、APN1、APN2、APN3、ADP/ATP转运蛋白、V-ATP酶等。比较抗性品系和敏感品系Cadherin、APN1、APN2和APN3基因的序列全长,发现在An2Ab品系均没有发生基因的缺失、插入或导致翻译提前终止的突变,表明对Cry2Ab毒素的抗性与上述4个结合蛋白的基因突变无关。遗传连锁分析表明,Cadherin和APN3与抗性不连锁,APN1和APN2表现出一定的连锁性(P=0.041),怀疑在同一连锁群中存在其它基因与抗性相关。ABCA2缺失突变导致的翻译提前终止会导致澳洲棉铃虫对Cry2Ab毒素隐性抗性的产生,且丧失对Cry2A毒素的结合能力。本研究通过CRISPR/Cas9技术敲除了敏感品系SCD中ABCA2蛋白,可以使其丧失对Cry2Ab毒素结合能力,获得对Cry2Ab毒素的高水平抗性。而An和An2Ab品系的ABCA2基因序列完整且两品系间基因表达量没有差异,结合实验显示抗性敏感品系均可正常结合Cry2Ab毒素,表明An2Ab品系的显性抗性与ABCA2基因无关;遗传连锁分析也显示ABCA2基因与An2Ab品系的抗性不连锁。4.棉铃虫Cry2Ab抗性相关基因的定位及筛选采用集群分离分析法定位并利用SNP标记测序验证An2Ab中Cry2Ab抗性相关基因位置,结果显示Cry2Ab抗性连锁区域有4个,它们分别是棉铃虫9号染色体3.65-4.59M 和 7.05-8.10M 以及 10 号染色体 0.78-3.98M 和 11.86-12.82M。对 An2Ab和An品系中肠组织进行转录组测序,筛选抗性连锁区域内表达量差异两倍以上基因,共在9号染色体连锁区域获得15个,在10号染色体连锁区域获得13个注释基因。Uniprot网站查找并分析对应蛋白质的功能,预测与信号通路相关的蛋白可能与抗性相关。信号通路抑制剂生物测定结果显示,作用靶标分别为9号染色体连锁区域的Ras相关蛋白(Ral)及在10号染色体多有富集的G蛋白相关蛋白的两种抑制剂BQU57及LY404039可将An2Ab的Cry2Ab毒素诊断剂量死亡率由7%分别提升为73.3%和72.3%,同时喂食两种抑制剂可将死亡率提升至90%,几近恢复至敏感状态。相比之下,同时喂食两种抑制剂时ABCA2基因敲除品系SCD-A2-KO的死亡率(15%)与未喂食时(19%)相比没有显著变化。喂食两种抑制剂同时会提高对Cry1Ac毒素的敏感性。采用CRISPR/Cas9干扰技术降低Ral基因的表达量,当注射sgRNA浓度由200 ng/μl提高至600 ng/μl时,相同Cry2Ab和Cry1Ac毒素浓度下An2Ab品系的死亡率亦分别由33%上升至42%,由38%上升至81%;均显著高于未注射时的死亡率7%和19%。上述结果表明An2Ab对Cry2Ab抗性可能与Ral基因表达量上调有关,Cry2Ab显性抗性可能与An2Ab抗性品系GPCR/G蛋白信号通路的变化相关。