通过本实验室先前的工作,将基因OsSCL30b转入水稻中,获得T2代转基因植株。该基因所编码的蛋白属于RRM家族。RNA识别基序(RRM),也称为RNP基序列或CS2RBD。该蛋白质结构域对于RNA分子与特异物质和结构域的结合及其关键。RNA识别基序通常在序列上相对保守,是真核生物中广泛存在的蛋白质结构域。在转录调控过程中,有多重RRM蛋白质参与包括:前mRNA加工,替代剪切和编辑在内的受调控的每一个步骤。OsSCL30b的转基因植株在田间的生长表现出生育期延迟。为研究OsSCL30b水稻转基因植株生育期推迟的机理,由OsSCL30b经过酵母双杂交筛选得到本课题研究的基因OsVHA16,因其编码水稻V型H~+-ATPase中16kDa蛋白脂质亚基c的合成,是V型ATP酶的重要组成部分,故将其命名为VHA16进行研究。H~+-ATPase存在于几乎所有动植物细胞的质膜和各种内膜系统中,在建立跨液泡膜质子梯度、植物细胞内离子平衡的调节、促进液泡Na+区域化和提高植物耐盐性方面发挥着重要作用。在对拟南芥的研究中发现,其在盐胁迫和低温胁迫条件下,V型H~+-ATPase通过调节自身结构和活性以响应胁迫;当土壤中存在高盐、干旱和重金属等胁迫时,细胞的存活主要依靠维持和调节V型H~+-ATPase的活性。对该基因的生物信息学分析表明,该基因的启动子区域有多个与逆境相关的作用元件,推测其在非生物胁迫响应中可能存在一定的作用。因此,本研究主要探究了该基因在逆境处理下的表达,为研究其对水稻生育期延迟与非生物胁迫响应的关系提供依据。主要实验结果如下:1、对获取的OsSCL30b转基因植株T2代进行逆境处理,探究了表达OsSCL30b蛋白的转基因植株在逆境条件下的生长状况,结果显示该基因的表达能增强水稻对高盐、低温和高温的耐受性,对干旱不明显。在植物生长调节剂的处理下,OsSCL30b的表达量受ABA的影响较大。2、从cDNA文库中将OsVHA16基因进行克隆,通过生物数据库对OsVHA16基因的生物信息学方面进行了一定的分析:OsVHA16基因定位于水稻5号染色体上,cDNA大小为1657bp,开放阅读框为501bp,编码166氨基酸残基组成的蛋白,蛋白分子量约为16kD,等电点约8.64。上游启动子区域有ABRE,TATA,ATCT,CGTCA,TGACG等多个与逆境相关的顺式作用元件。3、通过定量PCR分析OsVHA16在各种非生物逆境下叶中的表达量,发现OsVHA16基因在不同逆境下有不同程度的响应,而在高温下OsVHA16的表达量被诱导的程度最高,在低温和干旱条件下也有较高表达。4、构建OsVHA16基因的原核表达载体PET-32a:OsVHA16,对融合蛋白的体外诱导表达做了研究,明确了在不利条件下表达OsVHA16蛋白的大肠杆菌的生长情况。结果表明,该蛋白可以提高大肠杆菌对高温和低温的耐性。5、为了研究在水稻中的表达机制,我们构建了OsVHA16基因的过表达载体和抑制表达载体,利用农杆菌介导法转入日本晴愈伤组织,得到转基因植株。后利用潮霉素检验和35S引物检测,确定转基因植株为阳性,为后续研究OsVHA16蛋白在水稻中的表达做了准备。