论文部分内容阅读
目的:肝细胞癌(Hepatocellularcarcinoma,HCC)是世界上第三大癌症,大多数患者需要几种化疗药物的治疗,然而HCC对化疗药物易产生耐药性,是患者化疗失败的主要原因之一。本研究通过检测BCAT1在HCC组织和HCC细胞株(HepG2和97H)中的表达,并进一步探讨BCAT1在HCC顺铂(cisplatin,CDDP)耐药中的作用及其调控机制,为ATO联合CDDP治疗HCC和药物靶向治疗HCC提供新的理论依据。方法:(1)运用western blot法和qRT-PCR法分别检测HCC组织和癌旁组织、HCC细胞株(HepG2和97H)和正常肝细胞(L02)中BCAT1的mRNA水平和蛋白水平。采用T检验方法比较组间有无差异。(2)HCC细胞对CDDP治疗常出现耐药现象,为了验证高表达的BCAT1是否在HCC的CDDP耐药中起到作用,首先运用小干扰RNA对HCC细胞株(HepG2和97H)中的BCAT1进行沉默,并用MTT法检测BCAT1沉默对CDDP处理过的HCC细胞活力的影响。同时,用流式细胞仪检测BCAT1沉默对CDDP处理过的HCC细胞凋亡的影响。(3)ATO在肿瘤治疗中有良好的效果,我们用western blot法检测ATO处理是否可以抑制HCC细胞中BCAT1的表达,并检测ATO和CDDP联合处理后HCC细胞中BCAT1的蛋白水平。(4)用MTT法检测ATO联合CDDP处理对HCC细胞(HepG2和97H)细胞活力的影响,同时检测BCAT1过表达对ATO联合CDDP处理过的HCC细胞(HepG2和97H)的细胞活力的影响。用流式细胞仪检测检测ATO联合CDDP处理对HCC细胞凋亡的影响,并检测BCAT1过表达对ATO联合CDDP处理过的HCC细胞凋亡的影响。结果:(1)实时荧光定量PCR结果表明HCC组织中BCAT1的mRNA水平显著高于癌旁组织,western blot法结果也表明HCC组织中BCAT1蛋白水平显着高于癌旁组织。然后我们用实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法检测HCC细胞(HepG2和97H)和正常肝细胞(LO2)中BCAT1的mRNA水平和蛋白水平。与LO2细胞相比,HepG2和97H细胞中BCAT1的mRNA水平和蛋白水平显著更高。(2)HepG2细胞用不同浓度的CDDP处理48小时,BCAT1siRNA处理的HepG2细胞对CDDP表现出更大的敏感性,并且比对照细胞具有较低的增殖率和较高的凋亡率。类似地,在97H细胞中BCAT1的降低可以增强细胞对CDDP的化学敏感性,表现为较低的增殖率和较高的凋亡率。(3)我们用2.5、5和10μM的ATO处理HCC细胞,并通过western blot法测定48小时BCAT1的蛋白表达。结果表明,ATO以剂量依赖性方式显著降低HCC细胞中BCAT1的蛋白表达。此外,5 μMATO处理以时间依赖性方式抑制BCAT1表达。之前已经描述了 ATO处理降低了 c-Myc表达,c-Myc其是BCAT1基因的反式作用因子。因此,HepG2细胞用5μM ATO或/和20μM CDDP处理48小时后,进行western blot法测定c-Myc和BCAT1表达。结果显示5 μM的ATO抑制c-Myc和BCAT1表达。(4)当HepG2和97H细胞用5 μM的ATO和20μM CDDP处理48小时。ATO处理的细胞显示出比正常细胞更低的增殖和较高的凋亡速率。然而,外源性BCAT1过表达细胞显示出比ATO处理的细胞更高的增殖和较低的凋亡。结论:(1)HCC组织和HCC细胞株(HepG2和97H)中BCAT1的mRNA和蛋白水平显著升高。(2)BCAT1沉默可以导致HCC细胞对CDDP更敏感,表明BCAT1表达降低可以抑制HCC的CDDP耐药。(3)ATO通过c-Myc来调节BCAT1蛋白的表达降低。(4)ATO处理可以降低HCC细胞的CDDP耐药性,并且这种降低可以被BCAT1过表达部分逆转,提示BCAT1可以在HCC细胞CDDP耐药中起到一定作用。目的:肝内胆管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)是发病率仅次于肝细胞肝癌(HCC)的原发性肝癌,约占原发性肝癌的10-15%。本研究通过研究ATO联合CDDP化疗对ICC细胞的影响,并探讨BCAT1在ICC耐药CDDP中的潜在调控机制,为ATO联合CDDP治疗ICC提供一定的临床参考。方法:(1)为了评估化疗药物敏感性,我们先用20μM CDDP处理或和5μM ATO联合处理ICC细胞(RBE和HUCCT1细胞)48小时,然后用MTT法检测ATO联合CDDP处理对ICC细胞活力的影响。(2)为了验证BCAT1表达是否参与ICC的CDDP耐药,我们用western blot法检测BCAT1分子和H2AX的表达,而H2AX分子用来检测药物处理后ICC细胞的DNA损伤。(3)为了进一步验证BCAT1在ATO联合CDDP化疗中的作用,首先我们通过彗星实验检测ATO联合CDDP对HUCCT1细胞凋亡的影响,然后运用小干扰RNA对HUCCT1细胞中的BCAT1进行沉默,最后再用彗星实验检测BCAT1沉默对ATO联合CDDP所诱导的细胞凋亡的影响。结果:(1)CDDP单独处理RBE细胞时,RBE细胞活力未出现显著的降低;但当ATO联合CDDP处理RBE细胞时,RBE细胞对CDDP敏感性增加,细胞增殖功能发生障碍,细胞活力明显降低。此外,在另一株HUCCT1细胞中也发现相似现象,ATO联合CDDP处理显著降低HUCCT1的细胞活力。(2)单独CDDP处理RBE细胞时对BCAT1和H2AX的蛋白水平没有明显的影响,统计学没有意义。然而,ATO联合CDDP处理既能明显诱导H2AX蛋白水平的升高,又能诱导BCAT1蛋白水平的降低。我们又用另一株ICC细胞株HUCCT1来验证ATO联合CDDP的药物效果,实验结果和RBE细胞很相似,ATO处联合CDDP处理既能明显诱导H2AX蛋白水平的升高,又能诱导BCAT1蛋白水平的降低。(3)在彗星实验中,DNA损伤越严重,彗星的尾部的DNA碎片越多,彗星尾部的面积长度以及荧光强度就越大,通过测量这些指标可以对DNA损伤和细胞凋亡程度进行定量分析。实验结果显示单独ATO和单独CDDP处理后,HUCCT1细胞的DNA损伤比对照组有微弱的增加,但没有显著性差异;而ATO联合CDDP处理可以诱导HUCCT1细胞明显的DNA损伤。接着我们用小干扰对BCAT1进行沉默,验证BCAT1在ATO联合CDDP所诱导的DNA损伤中的作用,结果显示BCAT1沉默后,ATO联合CDDP处理的ICC细胞株出现明显的彗星拖尾现象,细胞凋亡增加。结论:(1)ATO处理使ICC细胞对CDDP更敏感,RBE和HUCCT1细胞增殖被抑制。(2)ATO联合CDDP处理不仅抑制BCAT1的蛋白表达,还可以增加H2AX的蛋白表达。(3)BCAT1沉默可以增强ATO联合CDDP化疗所诱导的HUCCT1细胞DNA损伤,提示BCAT1可能参与ATO联合CDDP诱导的ICC细胞DNA损伤。