【摘 要】
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非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）可感染家猪、野猪、疣猪等猪科动物,引起非洲猪瘟（African swine fever,ASF）。ASF在全球各地均有流行,但目前尚无安全有效的疫苗对抗ASFV,仅能以快速检测及隔离政策从源头上防治ASF。ASFV颗粒具有五层结构,定位于不同位置的ASFV蛋白具有不同的功能。EP402R及KP177R蛋白均是定位于ASFV
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非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）可感染家猪、野猪、疣猪等猪科动物,引起非洲猪瘟（African swine fever,ASF）。ASF在全球各地均有流行,但目前尚无安全有效的疫苗对抗ASFV,仅能以快速检测及隔离政策从源头上防治ASF。ASFV颗粒具有五层结构,定位于不同位置的ASFV蛋白具有不同的功能。EP402R及KP177R蛋白均是定位于ASFV囊膜上的结构蛋白。现有研究发现,EP402R蛋白与ASFV介导的血吸附过程相关,但具体机制尚不明确。目前有关KP177R蛋白的研究较少。通过对EP402R蛋白及KP177R蛋白的结构研究,可以进一步探究其底物结合位点,深入了解其功能,有助于对ASFV介导的血吸附机制的研究,对ASFV疫苗的研制有重要的作用。本论文分别构建了EP402R及KP177R截短体的原核及真核表达载体,并在HEK293F哺乳动物细胞及大肠杆菌中表达。本论文利用亲和层析技术（NiNTA、MBP树脂层析）对目的蛋白进行初步纯化,并用SDS-PAGE凝胶电泳、分子筛层析及荧光检测分子筛检测目的蛋白的性质及纯度。对于能稳定且大量表达的目的蛋白经分子筛色谱法进一步纯化后进行结晶尝试。实验发现,EP402R五种截短体蛋白在HEK293F哺乳动物细胞及大肠杆菌中均无法稳定表达。对EP402R/KP177R/O61R在HEK293F哺乳动物细胞共表达时发现,KP177R和/或O16R蛋白无法辅助EP402R蛋白的稳定表达。在对KP177R蛋白的研究中发现,KP177R截短体可在HEK293F哺乳动物细胞中稳定表达,但表达量低;KP177R截短体在大肠杆菌中可稳定且大量表达,经纯化可得到质量较好的蛋白,并筛选出两种可能的结晶条件,但未优化出更好的蛋白晶体。GFP-KP177R融合蛋白无法在大肠杆菌中稳定表达;MBPN3S6N-KP177R融合蛋白在大肠杆菌中表达效果较差;MBP-N3S-KP177R及MBP-N3A-KP177R融合蛋白可在大肠杆菌中稳定且大量表达,经纯化可得到质量较好的蛋白,并进行了结晶条件的筛选,但未寻找到适宜其结晶的条件。
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