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背景与目的急性淋巴细胞白血病（ALL）是一种起源于淋巴细胞的造血系统恶性肿瘤,异常增生的B系或者T系原始/幼稚淋巴细胞在骨髓积聚并且抑制正常的造血功能,同时也可以侵犯骨髓以外的其他组织,如脑膜、淋巴结、性腺等。ALL占儿童白血病的70%以上,占成人白血病的20%左右。随着对于此类疾病的认识和研究的不断深入,治疗方案也不断改进和规范化,约80%的儿童ALL能够获得长期无病生存（DFS）,而成人ALL仅为30%-40%。微小残留病（MRD）以及多药耐药（MDR）的存在,是导致白血病复发和治疗失败的主要原因。因此,迫切需要在目前治疗的基础上进一步改进治疗策略,清除MRD并改善成人ALL的疗效和预后。越来越多的证据表明,ALL患者,尤其是复发难治性ALL患者的耐药与骨髓微环境密切相关。传统化疗通常是通过清除大量的克隆细胞群来达到治疗目的。但是,藏匿在骨髓龛中的ALL细胞却能够逃脱化疗药物的杀伤作用,这与这些细胞接收到来自骨髓中基质细胞的促生存和药物耐药的信号作用密不可分。CXCR4/CXCL12信号轴在白血病细胞滞留于骨髓龛中从而躲避化疗药物的毒性方面发挥关键作用。该轴被激活后,可以活化骨髓微环境中复杂的信号因子网络,参与到白血病细胞的归巢、生存增殖、髓外浸润等重要过程中,从而促进了疾病的发生、发展甚至恶化。应用药物靶向阻断CXCR4/CXCL12信号轴,打破ALL细胞与骨髓基质间的相互作用,促使ALL细胞脱离骨髓微环境的保护状态,增强化疗药物的杀伤作用,从而降低MDR的发生并促进MRD的清除。本研究旨在研究靶向阻断CXCR4/CXCL12信号轴对于逆转ALL耐药和诱导凋亡的作用;同时也为临床开发更多的小分子抑制剂及相关靶向治疗药物提供理论基础和实验数据,从而并进一步引导ALL治疗模式的转换,从主要针对恶性肿瘤细胞的单一治疗到针对ALL及其赖以生存的微环境的联合治疗。对象与方法1.细胞分离与培养:取郑州大学附属肿瘤医院血液科5名复发难治性B-ALL患者(原始细胞数≥90%且外周血白细胞计数≥10.0×109/L)的骨髓液各10mL,用淋巴细胞分离液分离出淋巴细胞,并用含有20%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养液培养备用,24h换液1次,培养时间≤24h。脐带间充质干细胞（UC-MSCs）购于山东省细胞组织库,用含有10%FBS的DMEM/F12（1:1）培养液培养,每48-72h换液1次,当UC-MSCs生长到融合成片时,用含0.25%EDTA的胰蛋白酶消化传代,传代数≤5代。2.ALL原代细胞与UC-MSCs共培养体系的建立:在6孔培养板中每孔接种1×105个的UC-MSCs,培养约24 h后,显微镜下观察,融合度达到90%后,用PBS洗去未黏附的细胞,并冲洗去除残存的脐带间充质干细胞培养液。然后,在6孔培养板每孔中加入1×106个ALL原代细胞,形成共培养体系,并用含10%FBS的RPMI 1640培养液继续培养。3.流式细胞术检测ALL原代细胞膜表面CXCR4的表达:实验分为2大组,分别为ALL原代细胞单独培养组和ALL原代细胞与UC-MSCs共同培养组;同时再各自分为4个小组:空白对照组加入含10%FBS的RPMI 1640培养液、AMD3100（Plerixafor）单药组（浓度为5μg/mL,药物浓度据相关文献确定）、VCR单药组（浓度为1μmol/L,药物浓度据相关文献确定）、VCR+AMD3100联合药物组,总计8组,每组设2个复孔。于加药作用24h后收集上清液中的ALL细胞,并用流式细胞仪检测各组ALL细胞膜表面CXCR4的表达强度。4.ELISA方法检测CXCL12细胞因子的浓度:留取上组实验中各组的细胞培养上清液,用人CXCL12 ELISA试剂盒检测上清液中UC-MSCs分泌的CXCL12浓度。5.Annexin V-FITC/PI双染法检测ALL原代细胞的凋亡率:分组及加药情况同CXCR4表达检测组。于加药作用24h后收集培养上清液中的ALL细胞,并用流式细胞仪检测各组ALL原代细胞的凋亡率。6.Western blot法检测ALL原代细胞凋亡相关蛋白的表达:实验共分6组,分别为ALL原代细胞单独培养组、ALL细胞单独培养+VCR单药（浓度为1μmol/L,药物浓度据相关文献确定）组、ALL细胞与UC-MSCs共培养组、共培养+AMD3100（Plerixafor）单药组（浓度为5μg/mL,药物浓度据相关文献确定）、共培养+VCR+AMD3100联合药物组,于加药作用24h后每组收集至少5.0×106个ALL细胞,提取总蛋白,并应用Western blot法检测Bcl-2、Bax的表达情况,以GAPDH作为内参对照。7.对以上实验数据进行统计学分析,应用IBM SPSS Statistics 24.0软件分析结果。计量数据用?X±S表示;比较两样本均数时,使用独立样本t检验,P<0.05,认定为差异有统计学意义。结果1实验组中ALL原代细胞膜表面CXCR4的表达变化ALL细胞单独培养组中:空白对照组CXCR4的平均荧光强度（MFI）为（335.24±12.85）,AMD3100组为（199.83±40.23）,较对照组明显降低（P=0.001）;VCR组的MFI较对照组增加至（475.22±69.17）（P=0.007）;VCR+AMD3100组较VCR组的MFI下降至（330.13±42.82）（P=0.012）。ALL细胞与UC-MSCs共培养组中:空白对照组MFI为（261.87±91.07）,AMD3100组的MFI较对照组下降至（134.71±21.78）（P=0.035）;VCR组MFI较对照组增加至（426.00±13.66）（P=0.012）;VCR+AMD3100组较VCR组下降至（275.78±54.20）（P=0.002）。2实验组中UC-MSCs分泌的CXCL12浓度变化ALL细胞单独培养组中的CXCL12浓度均低于检测范围。ALL细胞与UC-MSCs共培养组中:对照组与AMD3100组的CXCL12浓度分别为（0.698±0.088）ng/mL、（0.751±0.063）ng/mL,无显著差异（P=0.307）;VCR组浓度为（1.351±0.044）ng/mL,较对照组明显增高（P=0.000）;VCR+AMD3100组浓度为（1.108±0.041）ng/mL,较VCR组降低,且具有统计学意义（P=0.000）。3实验组中ALL原代细胞的凋亡率单独培养组中:VCR组细胞凋亡率较对照组的（64.76±2.37）%增加至（84.04±1.16）%（P=0.000）;VCR+AMD3100组的细胞凋亡率为（81.13±2.71）%,与单药VCR组相比,无显著差异（P=0.058）。共培养组中:对照组的ALL细胞凋亡率为（57.06±3.41）%,AMD3100组的凋亡率为（73.39±3.16）%,较对照组明显增加（P=0）;VCR+AMD3100组的细胞凋亡率由VCR单药组的（76.6±2.93）%增加至（82.47±1.03）%（P=0.003）。单独培养组与共培养相比较:单独培养的ALL细胞在与UC-MSCs共培养后凋亡率由（64.76±2.37）%下降至（57.06±3.41）%（P=0.003）;单独培养和共培养的VCR组,细胞凋亡率分别为（84.04±1.16）%和（76.6±2.93）%,共培养组的凋亡率出现明显下降（P=0.001）。4实验组中ALL原代细胞凋亡相关蛋白的表达情况共培养组中:AMD3100组与对照组相比,促凋亡蛋白Bax表达上调,抗凋亡蛋白Bcl-2下调;VCR+AMD3100组与VCR组相比,促凋亡蛋白Bax表达变化不明显,抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调。单独培养组与共培养相比较:对照组中,ALL细胞在与UC-MSCs共培养后,促凋亡蛋白Bax表达下调,抗凋亡蛋白Bcl-2上调;VCR组中,共培养后促凋亡蛋白Bax表达较单独组下调,抗凋亡蛋白Bcl-2表达较单独组上调。结论1.UC-MSCs通过CXCR4/CXCL12信号轴实现对ALL细胞的凋亡保护作用和耐药促进作用。2.CXCR4拮抗剂（AMD3100）通过阻断CXCR4/CXCL12轴,抑制ALL细胞与微环境之间的联系,从而逆转UC-MSCs对ALL细胞的保护作用及耐药促进作用。