目的：　　 抗体由于具有高特异性和高亲和力的特性，使其在科学研究、疾病诊断和治疗中显示出无可比拟的优越性。随着市场对抗体药物的重视和需求，也对抗体的稳定性提出更高的要求。本研究为探索抗体的稳定性改构策略，以抗TNF-α抗体为研究对象，在VH/K基因的基础上利用定点突变方法和噬菌体抗体展示技术，构建噬菌体展示人源骆驼化单域抗体(sdAbs)基因库，筛选制备人源抗TNF-α的稳定、高亲和力的单域抗体。同时，构建膜稳定型TNF-α真核表达细胞株，制备抗体评价模型，以期进一步筛选出同时针对可溶型TNF-α(S-TNF)和膜稳定型TNF-α(M-TNFm)的抗体。　　 方法：　　 1.人源TNF-α重组蛋白的制备:采集健康人血液从中分离出淋巴细胞，经脂多糖刺激后提取RNA并逆转录为cDNA。将TNF-α基因克隆入原核表达载体pET28b(+)中，并转化入E.coliBL21(DE3)感受态细胞，制备并纯化人源可溶型TNF-α重组蛋白。　　 2.抗人TNF-αsdAbs基因库的构建:对人源抗体基因VH进行骆驼重链抗体(HcAb)的特征性改造，即利用定点突变技术将人普通抗体框架区FR2中，V37、G44、L45和W47这4个位点的氨基酸残基突变为HcAb中相对应的亲水性氨基酸残基F37、E44、R45和G47，并将突变成功的VH基因克隆入pCANTAB-5E载体，进而转化入Ecoli.TG1感受态细胞，构建抗人TNF-αsdAbs基因库。　　 3.抗人TNF-αsdAbs的特异性筛选及鉴定:以制备的人源TNF-α重组蛋白做为筛选抗原，对构建的噬菌体抗体库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”特异抗体的亲和筛选，并对经筛选得到的单克隆进行ELISA特异性鉴定。　　 4.M-TNFm重组蛋白的克隆表达:为使人TNF-α以一种不会被酶解的膜稳定型表达于细胞膜表面，应用PCR方法去除TNF-α转换酶的酶解部位编码序列(Val1-Pro12)成功构建TNF-α膜稳定型蛋白(M-TNFm)的突变体基因(mTNFm)。将其克隆入真核表达质粒，构建pCDNA3.1(+)-mTNFm-EGFP重组质粒，并经Lipofectamine2000脂质体瞬时转染后，瞬时表达M-TNFm蛋白。　　 5.抗体评价模型的构建:以小鼠成纤维细胞(L929)为靶细胞，观察S-TNF和M-TNFm对其细胞毒性作用;加入抗TNF-α抗体后，观察抗体对L929细胞的保护作用;以此确定制备的S-TNF和M-TNFm是否可用于抗体的活性评价。　　 结果：　　 1.制备了人S-TNF重组蛋白:构建pET28b(+)-TNF-α重组质粒并在E.coliBL21(DE3)中实现了人TNF-α的可溶性表达。经镍柱及AKATA系统纯化得到纯度较高的S-TNF重组蛋白。　　 2.成功构建了抗人TNF-αsdAbs基因库:通过PCR定点突变技术成功将人源抗体VH基因FR2区4个疏水性氨基酸残基突变为亲水性氨基酸残基。将突变成功的VH基因克隆入pCANTAB-5E载体，转化入Ecoli.TG1构建抗人TNF-αsdAbs基因库，库容量为3×107。　　 3.抗人TNF-αsdAbs的特异性筛选:使用噬菌体抗体展示技术筛选出2株ELISA值较高的特异性抗人TNF-αsdAbs。　　 4.人M-TNFm的克隆表达:成功制备了mTNFm突变体基因，构建了真核表达质粒pCDNA3.1(+)-mTNFm-EGFP。采用Lipofectamine2000脂质体法将质粒瞬时转染进293FT细胞，荧光显微镜下观察到绿色荧光，转染效率为38％。　　 5.抗体评价模型的构建:以L929细胞为靶细胞，制备的S-TNF和经转染表达M-TNFm的293FT细胞对其都有细胞毒性作用;经抗TNF-α抗体中和后，对L929细胞杀伤作用减小;抗体评价模型基本构建成功，制备的S-TNF和M-TNFm可以用于制备抗体的活性评价。　　 结论：　　 1.基于定点突变技术和噬菌体抗体展示技术，成功筛选制备了人源抗TNF-α特异、稳定的骆驼化人源sdAbs，为其他稳定性人源基因工程抗体的制备提供理论依据和技术基础。　　 2.构建了用于评价靶向S-TNF和M-TNF的抗TNF-α抗体的细胞模型，不仅为抗TNF-α抗体得评价奠定基础，同时为针对S-TNF和M-TNF不同型TNF-α特异功能抗体的筛选提供新的思路。