【摘 要】
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hERG（human ether-a-go-go-related gene）通道在调节心脏兴奋性和维持正常心律方面起关键作用。研究hERG通道的门控机制对了解其独特功能的结构基础及通道功能异常致病的分子基础有重要意义。在本课题组的前期研究中发现,在去除了C型失活的hERG通道中仍存在失活现象,推测hERG通道可能存在另一种失活—N型失活。N型失活通常用“球链”模型解释,其关键球体存在N端,当通道被
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hERG（human ether-a-go-go-related gene）通道在调节心脏兴奋性和维持正常心律方面起关键作用。研究hERG通道的门控机制对了解其独特功能的结构基础及通道功能异常致病的分子基础有重要意义。在本课题组的前期研究中发现,在去除了C型失活的hERG通道中仍存在失活现象,推测hERG通道可能存在另一种失活—N型失活。N型失活通常用“球链”模型解释,其关键球体存在N端,当通道被激活时,球体被链拖拽至孔道内,与通道内的受体结合阻塞通道从而产生失活。N端的五个连续带电残基KIKER团簇是hERG通道N端近端域中的关键区域,本研究推测KIKER团簇为球链结构的球体,受体可能由hERG通道孔域上的三个区域—疏水空腔顶部和中部,内门/交叉束门上的位点提供。本研究通过二硫键桥连法、全细胞膜片钳和Pymol结构分析通道结构,研究hERG通道中KIKER团簇与三个区域间的距离关系来验证上述假设。主要研究结果如下:1.首先将半胱氨酸突变分别引入KIKER团簇的E365,疏水空腔顶部T623、S624,疏水空腔中部Y652、F656,内门/交叉束门Q664位点中,产生6种半胱氨酸单突变通道,分别灌流还原剂DTT以打开生成的二硫键。结果表明六个单突变通道灌流DTT后的尾电流增长与野生型hERG通道灌流DTT的尾电流增长并无显著不同,单突变半胱氨酸的通道并没有产生不同于野生型hERG通道的二硫键;但灌流DTT后的通道尾电流与未灌流DTT的单突变通道本身有显著性不同,证实了还原剂DTT确实具有破坏二硫键的作用。2.再将KIKER团簇的E365分别与疏水空腔顶部T623,S624,疏水空腔中部Y652,F656,内门/交叉束门Q664位点形成五个双突变通道E365C-T623C,E365C-S624C,S624C-Y652C,E365C-F656C,E365C-Q664C并灌流DTT,结果表明E365C-Q664C双突变通道在灌流DTT后尾电流增幅最大。为了验证实验的准确性,在E365C-T623C和E365C-Q664C双突变通道中灌流DTT后再灌流氧化剂TBHO2（其作用为二硫键形成创造氧化环境）。双突变的结果显示,E365C-Q664C灌流TBHO2后的细胞通道与灌流DTT后的通道相比能减小通道尾流且有显著性差异,但与野生型通道相比影响不显著。3.对E365C-Q664C通道施加time course程序延长激活的时长,目的是创造更多产生二硫键的机会从而使通道电流减小,并施加TBHO2氧化剂使电流进一步减小,最后灌流还原剂DTT测定通道电流增加的情况。其结果表明该电压程序下通道加入DTT与灌流TBHO2时具有极显著差异,与稳态激活程序下的同一通道相比电流进一步减小。4.对单双突变通道施加rate-of-activation电压程序,E365C-Q664C通道的尾电流归一化值大于E365C-T623C和野生型hERG通道。E365C-Q664C通道的失活率高这一现象证明了这两个位点间生成的二硫键很有可能是在失活门控运动时产生的。综上所述,实验结果均表明E365C-Q664C通道形成二硫键,我们猜测hERG通道的门控失活运动的情况是:E365所在的N端的KIKER团簇充当N型失活中“球链”中的球体,在通道转变为失活态时球体运动到S6螺旋上的内门/交叉束门附近并与之相互作用发生N型失活。
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