T-2毒素是一种由三线镰刀菌产生的单端孢霉烯族(Trichothecenes, TCTCs)毒素,广泛分布于自然界,尤其对粮谷作物的污染范围广程度重。经食物连续摄入T-2毒素会对人类和动物的健康造成严重危害,表现出对生殖发育系统的母体毒性和胎仔毒性。T-2毒素的危害受到了社会的广泛关注,但由于监测标准的缺乏,我国至今未能形成健全的T-2毒素安全性评估方案。且现有体内实验研究对T-2毒素的发育毒性作用是母体强烈毒性的间接导致；还是通过胎盘屏障对胚胎产生直接毒性作用持有不同意见。因此,准确评价T-2毒素的胚胎发育毒性以及阐明其毒性机制对于制定我国的T-2卫生限量标准,防治其危害,维护人民健康有着积极意义。本研究将以T-2毒素的发育毒性评价及其作用机制做为研究目的,建立体外替代实验模型--胚胎干细胞试验(EST)模型来评价T-2毒素的发育毒性,并利用此模型来探讨T-2毒素胚胎毒性的作用靶点与作用机制,重点关注T-2毒素对胚胎干细胞(ESC)线粒体的毒性作用,包括T-2毒素作用于ESC线粒体从而产生的直接毒性效应,以及通过对分化过程中的ESC线粒体新生与功能的抑制从而对其分化能力的抑制作用。主要研究内容与结果如下：1.选用小鼠胚胎干细胞D3 (ES-D3)和小鼠胚胎成纤维细胞(3T3细胞),按照欧洲替代方法研究中心(ECVAM)推荐的实验操作流程,建立胚胎干细胞试验模型,选择已知发育毒性药物(氟尿嘧啶、青霉素等)对模型的有效性进行验证,氟尿嘧啶为强胚胎毒性,青霉素为无胚胎毒性,其结果与ECVAM一致,本研究建立的EST模型预测结果准确可信,可用于受试物发育毒性评价。2.应用EST对T-2毒素进行评价,表明T-2毒素为强发育毒性化合物,T-2毒素对ES细胞的细胞活力半数抑制率(IC50D3)值为1.48ng/ml,对小鼠ES细胞的分化能力半数抑制率(ID50)值为0.57ng/ml。3.T-2毒素染毒24 h,可引起小鼠ESC氧化应激并造成氧化还原状态失衡,氧化损伤与T-2毒素表现出剂量(0.5,1,2ng/ml)依赖性关系。荧光照片显示ES细胞内活性氧生成增加,分光光度法检测发现ESC的抗氧化防御酶(SOD、GPx)的活性下降,脂质过氧化产物丙二醛(MDA)增加,单细胞凝胶实验观察到ES细胞DNA损伤,提示T-2毒素造成ESC氧化损伤。4.T-2毒素染毒24h,在中、高剂量组检测ESC的线粒体通透性转运孔(PTP)开放,细胞色素从线粒体释放入胞浆增加,线粒体膜电位下降。提示T-2毒素可作用于ES细胞的线粒体凋亡途径,激发下游caspases级联活化。5.T-2毒素染毒24h,在中、高剂量组(1,2ng/ml)流式细胞术可见ESC周期中G0/G1延长,高剂量T-2毒素组(2ng/ml)同时伴随S期细胞比例显著减少,提示T-2毒素改变ES细胞周期；同时发现ES凋亡率与T-2毒素干预存在量效关系；RT-PCR与Western blot结果显示凋亡相关因子p53、Bax/bcl-2、caspase-9、caspase-3的表达上调,且与T-2毒素作用存在量效关系。自由基清除剂Trolox预处理可以减轻T-2对ES的氧化损伤以及细胞凋亡,进一步证实T-2毒素引起ESC氧化应激并激活线粒体途径介导的细胞凋亡可能是其发育毒性的分子机制之一。6.小鼠ESC体外培养表现出多向分化的能力,可以诱导分化成各种细胞,其中以心肌细胞为特定标志来检测其分化能力。按照ECVAM推荐的培养方法,ESC可分化为心肌细胞,T-2毒素抑制ESC向心肌细胞的分化,表现为心肌特异性基因(α-MHC)标志性蛋白α-actinin的降低。参照T-2毒素对ESC的分化抑制能力数据(ID50=0.57ng/ml),选用0.5ng/ml T-2毒素处理分化过程中的ESC 24h,72h,120h。发现T-2毒素染毒时间与其引起ESC氧化应激、抑制线粒体生物合成与功能存在时效关系。7.0.5 ng/ml T-2毒素作用72 h与120h,ES细胞内ROS大量蓄积,抗氧化防御酶(SOD、GPx)活性下降,脂质过氧化产物丙二醛(MDA)增加,提示低剂量T-2毒素染毒可时间依赖性的加重ESC氧化损伤。8. Real-time PCR与Western blot结果显示ROS蓄积量随时间增加,磷酸化p38MAPK水平下降,线粒体生物合成的重要调节因子PGC-1α,NRF-1与mtTFA的基因与蛋白表达降低,线粒体标志蛋白COXIV的基因与蛋白表达量下降,提示分化的小鼠ESC线粒体生物合成伴随T-2毒素染毒时问依赖性抑制。线粒体力能学分析可见分化的ESC在T-2毒素干预后线粒体呼吸功能下降,ATP生成活力抑制,ESC线粒体膜电位下降,线粒体的数量与功能的下降进而抑制ES细胞的分化能力。9.自由基清除剂Trolox预处理可以减轻T-2对ESC的氧化损伤以及对ES细胞线粒体生物合成的抑制。提示T-2毒素发育毒性的另一作用机制可能是低剂量T-2毒素引起ES细胞氧化应激并抑制ESC生物合成,降低ESC线粒体功能,线粒体数目和功能的不足难以满足ESC分化过程中氧耗与供能的需求,进而抑制了ESC的分化能力。