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糖化酶,全称葡萄糖淀粉酶(Glucoamylase EC.3.2.1.3),又称淀粉葡萄糖苷酶,功能在于从淀粉、糊精或糖原等碳水化合物的非还原性末端释放β-D-葡萄糖。糖化酶是水解淀粉产生葡萄糖的主要酶类,因此被广泛地应用于食品、医药、发酵等工业,具有很高的商业价值,是我国产量最大的酶制剂产品之一。目前,工业中广泛使用黑曲霉、泡盛曲霉等为生产菌株来提取糖化酶。本文首先利用PCR方法从糖化酶工业生产菌株F0410染色体扩增出包括ITS1、ITS2的部分序列和5.8S rDNA完整序列的保守系列,通过序列测定及比对分析确认该菌种为黑曲霉。根据GenBank上公布的黑曲霉糖化酶基因序列设计引物,通过PCR扩增得到黑曲霉F0410的糖化酶基因,扩增产物为3327 bp,其中糖化酶编码基因为2167 bp,推衍得到的氨基酸序列有640个氨基酸残基。PCR扩增出的glaA基因片段经试剂盒纯化后插入到载体pBC-Hygro的SmaⅠ位点,构建重组质粒pBC-Hygro-glaA。构建了黑曲霉F0410的PEG-原生质体转化系统。用重组质粒pBC-Hygro-glaA进行原生质体转化。经多次转化在潮霉素B抗性平板上共获得123株转化子,从中挑选酶活力提高的6株转化子进行摇瓶发酵和糖化酶基因拷贝数的研究。在染色体整合2-3倍的糖化酶基因对糖化酶的过量合成是适宜的,糖化酶的活力比出发菌株提高了12.7%-23%,当在染色体整合的糖化酶基因拷贝数达到出发菌株的8倍时,糖化酶的活力仅提高了6%。经初筛和复筛,最终获得了酶活力显著提高的转化子GB0506作进一步的研究。初步确定了重组菌GB0506适宜的培养基和发酵条件,最优的摇瓶发酵条件是30 g/L酵母膏,20 g/L棉籽粉,2 g/L硝酸铵和80 g/L工业葡萄糖,培养基pH 5.5,接种量为8%。在优化条件下对重组菌GB0506和出发菌株F0410进行摇瓶发酵,在整个发酵过程中,GB0506的糖化酶活力稳定高于F0410,在144 h发酵终了时,转化子GB0506的糖化酶活力比出发菌株F0410提高了17.5%。