【摘 要】
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丙氨酸作为20种基本氨基酸之一,有D型和L型之分,L-丙氨酸和D-丙氨酸在食品、医药和化妆品领域都有广泛应用。本文以Corynebacterium glutamicum ATCC13032 rps LK43R为出发菌株,采用自杀质粒p K18mobrps L介导的谷氨酸棒杆菌的基因编辑系统进行基因组编辑,分别构建了一株L-丙氨酸工程菌株和D-丙氨酸工程菌株。为了强化L-丙氨酸的合成,引入外源L-丙
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丙氨酸作为20种基本氨基酸之一,有D型和L型之分,L-丙氨酸和D-丙氨酸在食品、医药和化妆品领域都有广泛应用。本文以Corynebacterium glutamicum ATCC13032 rps LK43R为出发菌株,采用自杀质粒p K18mobrps L介导的谷氨酸棒杆菌的基因编辑系统进行基因组编辑,分别构建了一株L-丙氨酸工程菌株和D-丙氨酸工程菌株。为了强化L-丙氨酸的合成,引入外源L-丙氨酸脱氢酶,通过带质粒的形式过表达不同来源的ala D基因,最终确定效果最好的是来源于枯草芽孢杆菌的L-丙氨酸脱氢酶,将其三拷贝整合到出发菌的基因组上,L-丙氨酸产量大幅提高。在较高产量的基础上整合了大肠杆菌来源的丙氨酸输出基因ala E,加快L-丙氨酸的输出,同时敲除乳酸脱氢酶基因ldh A,导致生长变弱,产量降至一半,但是为了避免副产物乳酸的积累,敲除ldh A是必要的。在iol R位点用Psod启动子过表达葡萄糖激酶基因glk1,强化葡萄糖摄取,L-丙氨酸产量回升至没有敲除ldh A的水平,并继续整合双拷贝的pts G基因,加快葡萄糖的运输与利用。强化糖酵解关键酶基因gap A的表达,随后引入来自大肠杆菌ED途径关键酶基因edd和eda,L-丙氨酸产量逐渐升高,最终5 L发酵罐丙氨酸产量达到104 g/L。通过手性柱测试发现含有D-丙氨酸39 g/L左右,占了总产量的2/5。继续研究发现谷氨酸棒杆菌对D-丙氨酸的耐受性较高,因此尝试构建一株D-丙氨酸的谷氨酸棒杆菌生产菌株。首先引入外源二氨基庚二酸脱氢酶St DAPDH,使在敲除丙氨酸消旋酶基因alr和丙氨酸转氨酶基因ala T的基础上D-丙氨酸产量大幅度升高,随后根据L-丙氨酸的改造策略,在iol R位点过表达葡萄糖激酶基因glk1和整合eddeda基因,经5 L自动控制发酵罐进行分批补料发酵实验扩大培养,最终D-丙氨酸的产量达到58 g/L。基于StDAPDH的催化机制,以D-缬氨酸为例,在出发菌基因组上整合双拷贝ilv BNC操纵子后,通过敲除关键基因avt A和ilv E,并过表达dap DHSt基因,得到D-缬氨酸3 g/L;除此之外,对于非丙酮酸族的氨基酸,以D-谷氨酸为例,引入D-谷氨酸转氨酶,以D-丙氨酸为氨基受体,摇瓶发酵D-谷氨酸最高有1.8 g/L。
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