【摘 要】
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目的:探究小分子酪氨酸激酶抑制剂DCC-2036是否具有诱导肿瘤相关巨噬细胞从M2型重极化为M1型并抑制三阴性乳腺癌进展的作用。方法:1.体外构建巨噬细胞的M2型极化模型。选取C57BL/6小鼠中提取的骨髓原代巨噬细胞（BMDM）以及巨噬细胞代表细胞系RAW264.7,利用白介素10（IL10）进行诱导,48小时后运用流式细胞术、q-PCR和Western Blot实验检测IL10诱导后巨噬细胞中
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目的:探究小分子酪氨酸激酶抑制剂DCC-2036是否具有诱导肿瘤相关巨噬细胞从M2型重极化为M1型并抑制三阴性乳腺癌进展的作用。方法:1.体外构建巨噬细胞的M2型极化模型。选取C57BL/6小鼠中提取的骨髓原代巨噬细胞（BMDM）以及巨噬细胞代表细胞系RAW264.7,利用白介素10（IL10）进行诱导,48小时后运用流式细胞术、q-PCR和Western Blot实验检测IL10诱导后巨噬细胞中CD206、ARG和i NOS等极化标志物的表达情况,验证M2型巨噬细胞极化模型是否诱导成功;2.评估DCC-2036对M2型巨噬细胞重极化的影响。应用Western Blot实验,观察在DCC-2036的作用下,M2型巨噬细胞中极化标志物CD206、ARG和i NOS的表达变化;3.探讨DCC-2036通过作用于M2型巨噬细胞对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231和4T1的迁移和侵袭的影响。将DCC-2036处理过的M2型巨噬细胞以及DCC-2036处理过的M2型巨噬细胞产生的条件培养基（Conditioned medium,CM）分别与MDA-MB-231和4T1细胞进行共培养,通过Transwell实验,观察肿瘤细胞的迁移和侵袭能力的改变;4.建立小鼠乳腺癌原位模型。将4T1细胞注射到Balb/c小鼠的第四对乳腺皮下脂肪垫,随机分为实验组和对照组,实验组给予100mg/kg的DCC-2036隔天行灌胃治疗,对照组给予同体积的溶剂（由0.5%羧甲基纤维素/1%吐温80配制）处理。观察两组小鼠的肿瘤生长情况,评估DCC-2036在体内对三阴性乳腺癌细胞生长的作用;揭示DCC-2036是否能够在体内诱导肿瘤相关巨噬细胞从M2型向M1型转化。通过流式细胞术、免疫组化、免疫荧光和Western Blot实验检测对照组和DCC-2036治疗组的小鼠肿瘤组织中肿瘤相关巨噬细胞的CD86、i NOS、CD206和ARG等M1型、M2型极化标志物以及总巨噬标志物F4/80的表达变化;5.验证DCC-2036可以直接通过诱导肿瘤相关巨噬细胞重极化为M1型从而抑制小鼠体内三阴性乳腺癌的生长。将DCC-2036处理过的M2型巨噬细胞与4T1细胞共同注射到Balb/c小鼠的第四对乳腺皮下脂肪垫,构建共成瘤模型,观察小鼠的肿瘤生长情况。结果:1.经IL10处理后,巨噬细胞中CD206和ARG等M2型极化标志物表达增加,i NOS和IL23等M1型极化标志物表达降低,研究结果表明IL10能够成功诱导巨噬细胞向M2型极化;2.经DCC-2036处理后,M2型巨噬细胞的M2型极化标志物CD206和ARG表达降低,M1型极化标志物i NOS表达增加,表明DCC-2036能够抑制巨噬细胞的M2型极化,并促进M2型巨噬细胞重新向M1型极化;3.我们发现DCC-2036作用后的M2型巨噬细胞以及DCC-2036作用后的M2型巨噬细胞产生的条件培养基与三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231和4T1的共培养,均有效的抑制了MDA-MB-231和4T1细胞的迁移和侵袭能力,表明DCC-2036能够通过诱导M2型巨噬细胞的重极化来影响三阴性乳腺癌细胞的侵袭转移,且可能与巨噬细胞条件培养基中的分泌因子有关;4.在小鼠三阴性乳腺癌原位模型中,给予DCC-2036治疗的小鼠的肿瘤生长速度减慢、肿瘤的重量和体积减小,表明DCC-2036能够在体内有效抑制三阴性乳腺癌细胞的生长;流式细胞术、免疫组化、免疫荧光和Western Blot实验结果显示,DCC-2036治疗组的小鼠肿瘤组织中TAMs的M2型极化标志物CD206和ARG的表达降低,M1型极化标志物CD86和i NOS的表达增加。值得注意的是,总巨噬标志物F4/80表达无明显变化。表明DCC-2036能够在体内以一种不影响巨噬细胞总数量的方式,通过将TAMs重新极化为M1型巨噬细胞从而发挥抑制三阴性乳腺癌的作用;5.通过M2型巨噬细胞和4T1细胞的小鼠共成瘤模型,发现体外经DCC-2306处理的M2型巨噬细胞在小鼠体内抑制了4T1细胞的生长,表明DCC-2036可以直接通过对肿瘤相关巨噬细胞重极化的影响来抑制小鼠体内三阴性乳腺癌的生长。结论:DCC-2036通过诱导肿瘤相关巨噬细胞重极化为M1型巨噬细胞进而抑制三阴性乳腺癌的进展。
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