论文部分内容阅读
背景和目的:氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)与动脉粥样硬化形成密切相关。自噬在人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)中有降解ox-LDL的作用。Sirtuin1(SIRT1),一种新型抗动脉粥样硬化因子,是哺乳动物沉默信号调节因子2的同源物,对细胞的生存、代谢等生理活动起着十分重要的调节作用,可能是所有生物共同的寿命控制基因之一,并且有诱导自噬作用。本文研究SIRT1对HUVECs内ox-LDL聚集的影响,并初步探讨其作用是否与其促进ox-LDL自噬性降解有关。方法:1.流式细胞仪检测SIRT1抑制剂尼克酰胺(nicotinamide,NAM)和激动剂白藜芦醇(resveratrol,RSV)对Dil-ox-LDL在HUVECs聚集的影响;利用SIRT1小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA)转染构建SIRT1 si RNA内皮细胞模型,并用流式细胞仪检测其对Dil-ox-LDL在HUVECs聚集的影响。2.利用自噬相关基因Atg5小干扰RNA转染构建Atg5 si RNA内皮细胞模型,流式细胞仪检测其对白藜芦醇抑制Dil-ox-LDL在HUVECs聚集的影响;采用蛋白免疫印迹方法检测自噬流相关蛋白LC3、p62的蛋白含量,并用GFP-LC3质粒转染技术在荧光显微镜下观察各组LC3荧光点的数目;通过免疫荧光技术观察HUVECs中Dil-ox-LDL与溶酶体标志物Lamp1和Cathepsin D的共定位情况。结果:1.流式细胞术检测结果显示SIRT1 si RNA和NAM增加HUVECs中Dil-ox-LDL的荧光强度,RSV减少HUVECs中Dil-ox-LDL的荧光强度。2.敲减Atg5增加HUVECs中Dil-ox-LDL的荧光强度;与RSV组相比,Atg5 si RNA和RSV组的HUVECs中Dil-ox-LDL荧光强度增加。3.免疫印迹结果显示ox-LDL升高LC3-II和p62的蛋白表达,与单独ox-LDL组相比,SIRT1 si RNA+ox-LDL组和NAM+ox-LDL组LC3-II的蛋白表达降低,p62蛋白水平升高,RSV+ox-LDL组LC3-II的蛋白表达升高,p62蛋白水平降低。运用GFP-LC3质粒转染技术在荧光显微镜下观察发现SIRT1 si RNA和NAM减少LC3点状物数目,RSV增加LC3点状物数目。4.免疫荧光结果显示Dil-ox-LDL与Lamp1及Cathepsin D部分共定位,与Dil-ox-LDL单独组相比,SIRT1 si RNA和NAM减少Dil-ox-LDL和Lamp1及Cathepsin D共定位程度,RSV增加Dil-ox-LDL和Lamp1及Cathepsin D共定位程度。结论:SIRT1抑制剂及敲减SIRT1基因增加ox-LDL在HUVECs中的聚集,SIRT1激动剂则减少ox-LDL在HUVECs中的聚集,SIRT1的这种调控作用与其对自噬溶酶体途径的调节有关。