旋毛虫感染主要因食入生的或未熟的旋毛虫感染的肉类引起。当宿主摄入感染有旋毛虫成囊幼虫的肉类后,肌幼虫（muscle larvae）在胃内消化液的作用下脱囊,被胆汁激活为肠道感染性第1期幼虫（intestinal infective L1 larvae,IL1）,后者侵入肠上皮细胞（intestinal epithelium cells,IECs）内,经4次蜕皮后发育为成虫,雌雄成虫交配后产出新生幼虫（newborn larvae,NBL）,新生幼虫侵入肠黏膜的小血管/淋巴管,随血循环至全身各处,侵入骨骼肌内发育为成囊的肌幼虫,完成旋毛虫的生活史。IL1幼虫侵入宿主肠黏膜是旋毛虫建立感染的关键步骤,但侵入机制目前还尚未清楚。旋毛虫IL1幼虫的排泄分泌（Excretion/secretion,ES）蛋白或表面蛋白中的蛋白酶,首先与宿主肠黏膜接触,可能通过水解肠上皮细胞而介导旋毛虫幼虫对肠黏膜的侵入,但哪些蛋白酶参与了旋毛虫的侵入及其机制目前尚不完全清楚。本课组前期应用免疫蛋白组学,从旋毛虫IL1幼虫与成虫的ES蛋白中鉴定出了一种旋毛虫肽酶（Trichinella spiralis peptidase S1A subfamily,TsP;Gen Bank:XM＿003379300.1）,但TsP在旋毛虫侵入、虫体发育及生存的生物学功能则未见报道。本研究的主要目的是鉴定TsP的生物学特性及其在旋毛虫幼虫侵入肠黏膜中作用,并观察重组TsP（r TsP）免疫小鼠引起的体液与细胞免疫应答以及对旋毛虫攻击感染的免疫保护效果。材料方法1.实验动物,旋毛虫虫种,菌种和细胞4周雌性BALB/c小鼠购自河南省实验动物中心。本研究所用的旋毛虫为河南省南阳猪源旋毛虫T1（国际标准虫种标号为ISS534）。菌种为大肠杆菌BL21。IEC分离自小鼠小肠,培养成细胞单层后用于实验研究。2.TsP的生物信息学分析从NCBI获得TsP的m RNA序列和CDs序列,并运用生物信息学分析软件（Target P、TMHMM、SMART、Prot Param、SWISS-MODEL、Prot Scale、PSIPRED、Signal P）对TsP的理化性质进行分析;应用Bio Edit和MEGA软件对TsP进行多序列比对与进化树分析。3.r TsP抗原性分析重构TsP的重组表达质粒p QE-80L/TsP,导入BL21宿主菌内进行诱导表达,纯化后获得r TsP,免疫小鼠制备抗r TsP免疫血清。收集旋毛虫肌幼虫制备的粗抗原与ES抗原,通过Western blot分析r TsP抗原性。4.TsP在各个虫期的表达制备旋毛虫各个虫期的c DNA进行RT-PCR,检测TsP在不同虫期的转录情况;收集旋毛虫不同期虫体（肌幼虫、IL1、成虫及NBL）,制备虫体可溶性抗原,通过Western blot与免疫荧光试验（Immunofluorescence assay,IFA）,观察TsP在不同虫期的表达与定位。5.Far-Western和ELISA分析r TsP与IECs的结合制备IECs可溶性蛋白、胞核蛋白及胞质蛋白,通过ELISA观察r TsP与IECs蛋白的结合情况;然后应用Far-Western进一步观察r TsP与IECs蛋白、胞核蛋白及胞质蛋白的结合。6.IFA检测r TsP与IECs及鼠小肠黏膜组织的结合通过IFA与共聚焦显微镜观察r TsP与IECs的结合及细胞定位;制备正常小鼠肠黏膜组织切片,应用IFA观察r TsP与肠黏膜结合的特异性。7.体外幼虫侵入IECs与鼠小肠黏膜实验将胆汁激活的IL1幼虫与单层IECs共孵育2 h后,观察幼虫对IECs的侵入。剪取2 cm长的正常小鼠小肠,两端结扎后将与抗r TsP免疫血清或r TsP孵育后的IL1幼虫注入肠腔内孵育2 h,剪开后镜下观察幼虫对肠黏膜的侵入情况。8.r TsP免疫小鼠诱导的体液/细胞免疫及免疫保护将90只小鼠分为3组（r TsP免疫组、ISA 201佐剂组与PBS对照组,每组30只）,r TsP皮下接种免疫小鼠（20μg/只小鼠）,每次间隔2周,共计免疫4次。每次免疫后2周应用r TsP-ELISA检测免疫血清中抗TsP抗体Ig G、Ig G1/Ig G2a水平。应用ELISA检测免疫前与免疫后8周小鼠肠道总s Ig A和特异性s Ig A水平,并检测免疫前后小鼠脾与肠系膜淋巴结细胞的细胞因子IFN-γ及IL-4水平的变化。在末次免疫后2周,对免疫小鼠应用300条旋毛虫进行攻击感染,在感染后6 d与30 d麻醉后处死小鼠,分别观察r TsP免疫小鼠的肠道成虫和肌幼虫荷,计算成虫与肌幼虫的减虫率,并观察虫体形态与小鼠肠道及咬肌的炎症细胞浸润的变化,评价r TsP免疫小鼠对旋毛虫攻击感染的免疫保护效果。9.统计学处理实验数据用SPSS和Graphpad软件进行处理。采用t检验、单因素方差分析与卡方检验进行统计学分析,检验水平为α=0.05。结果1.TsP生物信息学相关性质分析应用NCBI,Ex Pasy,Signal P 5.0 serve及TMHMM Server v.2.0等在线软件对TsP（Gen Bank:XM＿003379300.1）进行分析,结果显示TsP序列全长780 bp,共编码259个氨基酸,相对分子量为28.7 k Da,p I为8.32。TsP无信号肽,N端有明显疏水区域,不含跨膜区,TsP蛋白亚细胞定位为其他类,有良好的抗原性,具有胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的结构域。TsP三级结构预测发现TsP有4个α螺旋,16个β折叠。组氨酸（His）、丝氨酸（Ser）及天冬氨酸（Asp）构成TsP酶活性的催化三联体。2.r TsP抗原性分析重构的重组质粒p QE-80L/TsP导入BL21宿主菌后经0.8 m M IPTG 30℃诱导6 h后,对表达产物用镍柱纯化后获得r TsP,制备的抗TsP免疫血清效价为1:10⁵。Western blot结果显示,r TsP能被旋毛虫感染血清和抗r TsP免疫血清识别,但并不能被正常血清识别,表明r TsP具有良好的抗原性。3.TsP在各个虫期的表达Western blot发现TsP在旋毛虫的各个虫期可溶性蛋白中均有表达（抗r TsP免疫血清能识别肌幼虫、IL1、成虫及NBL粗抗原中天然的TsP蛋白条带）。应用抗r TsP免疫血清进行的IFA结果显示,TsP在旋毛虫的不同虫期（肌幼虫、IL1、3 d与6 d成虫及NBL）都有表达,主要定位于旋毛虫的表皮及雌虫胚胎。4.Far-Western和ELISA分析r TsP与IECs的特异性结合将IECs蛋白进行Far-Western的结果显示,IECs蛋白与r TsP孵育后,能被r TsP免疫血清识别出9条条带（23.4-46.4 k Da）,IECs蛋白与IL1 ES蛋白孵育后,能被r TsP免疫血清识别出2条带（51.6 k Da和60.5 k Da）;但IECs蛋白与BSA蛋白孵育后,不能被r TsP免疫血清识别。为了进一步鉴定r TsP与IECs组分的相互作用,将IECs先与r TsP共孵育后再进行胞核与胞质蛋白分离,发现IECs全细胞蛋白能被r TsP免疫血清识别出5个条带（29.0-72.8 k Da）,IECs核蛋白能被r TsP免疫血清识别出2个条带（43.8k Da和29.0 k Da）,IECs质蛋白能被r TsP免疫血清识别1条29.0 k Da的蛋白带。而r TsP不能与C2C12蛋白结合。表明r TsP与IECs的结合部位是在IECs胞浆与胞核。不同浓度的IECs蛋白包被后与5μg/m L的r TsP孵育进行ELISA,发现在IECs蛋白包被浓度小于0.20μg/m L时IECs蛋白浓度越高,r TsP与IECs蛋白的结合越强,呈现IECs蛋白剂量依赖关系;应用2μg/m L的IECs蛋白包被后与不同浓度的r TsP蛋白孵育后进行的ELISA结果显示,在r TsP孵育浓度小于0.06μg/m L时r TsP蛋白浓度越高,r TsP与IECs蛋白的结合作用越强,结果表明r TsP能够与IECs蛋白结合,且这种结合具有r TsP与IECs蛋白剂量依赖性。5.IFA与共聚焦检测r TsP与IECs结合及定位将r TsP与IECs共孵育后进行IFA及共聚焦显微镜检查,发现r TsP能够与IECs特异性结合,给合部位在IECs的细胞核和细胞质,这与前面的ELISA结果相一致。将r TsP与正常小鼠小肠组织切片共孵育后进行的IFA结果发现,r TsP能够与正常小鼠小肠黏膜上皮结合,但与正常小鼠的肝脏和肺脏组织则没有结合,进一步证明了r TsP与IECs和鼠肠粘膜上皮细胞的结合具有特异性。6.体外细胞和体外小肠组织侵入实验将IL1幼虫与r TsP（或抗r TsP免疫血清,感染血清,正常血清）及IECs单层细胞共孵育2 h后,与PBS组相比较,r TsP组和BSA组的幼虫侵入率分别为83.44%和61.34%（χ2=12.004,P<0.005）,r TsP对IL1幼虫侵入IECs具有明显的促进作用,这种促进侵入作用具有r TsP剂量相关性（r=0.985,P<0.005）。但BSA对IL1侵入IECs则没有促进作用。同时发现抗r TsP免疫血清组、感染血清组和正常血清组的幼虫侵入率分别为38.73%、25.85%和67.94%（χ2=42.337,P<0.005）,结果表明抗r TsP免疫血清对旋毛虫侵入IECs具有部分阻断作用。r TsP血清对幼虫侵入IECs的部分阻断作用具有抗r TsP免疫抗体剂量依赖性（r=0.906,P<0.05）。将抗r TsP免疫血清,感染血清,正常血清或r TsP孵育后的IL1幼虫注入两端结扎后的2 cm肠腔内孵育2 h,与PBS组相比较,发现抗r TsP免疫血清组、感染血清组和正常血清组的幼虫侵入率分别为46.17%、34.67%和65.17%（χ2=15.757,P<0.001）,结果表明抗r TsP免疫血清对旋毛虫侵入小肠黏膜具有部分阻断作用。r TsP血清对幼虫侵入小肠黏膜的部分阻断作用具有抗r TsP免疫抗体剂量依赖性（r=0.881,P<0.05）。r TsP组和BSA组的幼虫侵入率分别为88.17%和66.17%（χ2=8.640,P<0.005）,r TsP对IL1幼虫侵入小肠黏膜具有明显的促进作用,这种促进侵入作用具有r TsP剂量相关性（r=0.973,P<0.005）。但BSA没有促进幼虫侵入小肠黏膜的作用。7.r TsP的免疫保护作用应用r TsP进行4次免疫后,与免疫前相比较,血清中特异性Ig G、Ig G1/Ig G2a水平明显升高(F_{Ig G}=932.349,F_{Ig G1}=288.240,F_{Ig G2a}=252.490,P<0.001),但ISA 201佐剂组和PBS组的抗体水平的差异无统计学意义（P>0.05）;免疫后4、6及8周,Ig G1抗体水平明显高于Ig G2a(t_4w=10.451,t_6w=9.853,t_8w=10.841,P<0.05),表明r TsP免疫小鼠诱导了Th2型为主的体液免疫应答。末次免疫后8周,r TsP组的总s Ig A和TsP特异性s Ig A与免疫前相比较均有明显升高。3组小鼠肠液中特异性s Ig A水平的差异具有统计学意义（F=64.678,P<0.005）,r TsP免疫组明显高于ISA 201佐剂组和PBS组（t₁=8.407,t₂=11.18,P<0.001）。在免疫后8周,r TsP免疫小鼠的细胞因子（IFN-γ和IL-4）水平,显著高于ISA 201佐剂组和PBS组(脾脏-t_IL-4=50.933,P<0.001;脾脏-t_IFN-γ=53.829,P<0.001;MLN-t_IL-4=66.771,P<0.001;MLN-t_IFN-γ=66.097,P<0.001)。感染6 d与30 d,免疫小鼠的肠道成虫和肌幼虫减虫率分别为38.60%和41.93%(F _AW=159.895,F_ML=132.928,P<0.001)。结果表明,r TsP皮下免疫小鼠诱导了全身性与肠黏膜局部的Th1/Th2混合型免疫应答及明显的免疫保护作用。此外,还发现r TsP免疫可增强小鼠肠黏膜的炎症细胞浸润（可能与肠道排虫有关）,但可减轻感染小鼠肌肉的炎症反应。结论1.构建了旋毛虫肽酶TsP的重组表达质粒p QE-80L/TsP,并表达纯化了r TsP;2.TsP在旋毛虫的各个发育期都有表达,主要定位于虫体角皮层及雌虫子宫内胚胎;3.r TsP能与小鼠肠上皮细胞和肠黏膜特异性结合,r TsP可促进旋毛虫侵入肠上皮细胞;4.r TsP免疫小鼠可产生全身性与肠黏膜局部的Th1/Th2混合型免疫应答,对旋毛虫攻击感染具有明显的免疫保护作用;TsP是一种旋毛虫对宿主肠黏膜的侵入相关蛋白,可作为一种抗旋毛虫疫苗的潜在的靶抗原。