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L-苏氨酸是一种必需氨基酸,主要应用于医药、食品和饲料添加剂等领域。随着L-苏氨酸市场需求量不断增加,提高L-苏氨酸的发酵产量和糖酸转化率,降低生产成本,成为代谢工程研究的一个重要课题。本研究以L-苏氨酸大肠杆菌工程菌THRD为出发菌,利用CRISPRi代谢干扰技术探究调控合成代谢途径相关基因的表达水平对L-苏氨酸合成的影响,从而实现平衡代谢网络,提高L-苏氨酸的合成效率。本研究依据CRISPRi作用机制,建立了基于阿拉伯糖诱导的代谢干扰体系,该体系中基因dcas9整合在基因组上并受阿拉伯糖启动子的调控,采用pGRB质粒表达相应的sgRNA对特定基因进行干扰。利用上述干扰体系调控EMP、TCA和支路代谢途径中11个基因的转录水平,研究基因表达水平变化对L-苏氨酸合成效率的影响。发酵结果显示,调控基因gltA、pfkA和zwf的转录水平显著提高了 L-苏氨酸的合成效率,对应菌株的L-苏氨酸产量分别为64.7 g/L、64.1 g/L和60.2 g/L,较对照菌株(50.9 g/L)分别提高了 27.1%、25.9%和18.3%糖酸转化率分别为0.38 g/g、0.38 g/g和0.40 g/g,较对照菌株(0.34 g/g)分别提高了 11.8%、11.8%和17.6%。调控基因ackA、pck和pta的转录水平,也能适度增加L-苏氨酸的积累量,对应菌株的L-苏氨酸产量分别为57.2 g/L、56.9 g/L 和 56.0 g/L 较对照菌株(50.9 g/L)分别提高了 12.4%、11.8%和 10.0%。将基因gltA、pfkA和zwf串联组合,构建多基因干扰质粒,研究多基因同时干扰表达对L-苏氨酸合成效率的影响。发酵结果显示,同时调控基因zwf、gltA和同时调控基因zwf、pfkA、gltA的转录水平,对应菌株L-苏氨酸产量分别为56.8 g/L和59.5 g/L,较对照菌株(50.9 g/L)分别提高了 12.9%和18.3%。糖酸转化率分别为0.38 g/g和0.37 g/g较对照菌株(0.34 g/g)分别提高了11.8%和8.8%。干扰体系需要添加阿拉伯糖进行诱导表达,本研究进一步分析了诱导剂阿拉伯糖的添加时间及添加量对L-苏氨酸合成效率的影响。发酵结果显示,发酵培养2-4 h添加诱导剂,L-苏氨酸合成效率显著提高,2-4 h添加诱导剂L-苏氨酸的产量(59.4 g/L)较Oh(52.7 g/L)和6h(54.6g/L)添加诱导剂分别提高了 12.7%和8.1%;改变诱导剂添加量对L-苏氨酸合成效率没有明显影响。干扰体系采用质粒的形式表达相应的sgRNA。为了避免质粒不稳定、菌体负担重等缺点,本研究进一步将sgRNA表达模块整合到基因组上,构建无质粒的干扰菌株。分别用PT7启动子和Ptrc启动子控制基因gltA、pfkA和zwf对应的特异性sgRNA的表达,构建相应的干扰整合菌株,并进行发酵培养测试。发酵结果显示,与原菌株和对应的质粒干扰菌株相比,无质粒干扰菌株L-苏氨酸的合成效率没有明显提升。通过比较THRD-5和THRD-8菌株产酸情况,比较两种启动子表达特异性sgRNA对L-苏氨酸合成的影响。发酵结果显示,PT7启动子表达的特异性sgRNA对L-苏氨酸合成效率的正向作用优于Ptrc启动子,THRD-5菌株L-苏氨酸产量(57.4 g/L)较THRD-8(54.6 g/L)高 5.1%。