反射式荧光成像技术可以连续、无创、高通量地在体检测小动物体内被标记的细胞和分子，追踪各种疾病的形成和发展。然而这种成像方式的缺陷在于在体成像时皮肤和食物自发荧光的存在会大大降低系统的探测灵敏度，使感兴趣荧光团难以准确监测和定位。另外，为了同时监测多种生物过程，需要利用多种荧光标记物标记不同的分子进行荧光成像。这些荧光团光谱混叠，无法独立分辨它们各自的信息。而多光谱分离法可用于反射式荧光成像时自发荧光的去除和多种感兴趣荧光团的分离。本文提出一种多光谱分离方法：从5-6幅多光谱荧光图像中在体提取自发荧光和感兴趣荧光团的纯光谱数据后，再使用线性分离算法去除自发荧光，并区分不同的目标荧光团。将本算法运用到反射式荧光成像系统中，去除了自发荧光的影响，实现了分别表达TagRFP和mLumin荧光蛋白的两种BL21大肠杆菌样品的分离。这两种荧光团与自发荧光的信噪比在分离前后分别从9.23dB和4.70dB提高到35.69dB和24.91dB。此外，在感兴趣荧光团的信号较微弱以致于其空间分布无法预测的情况下，本文对上述算法进行了改进。首先用初始化中心点的分类算法对原始多光谱荧光图像按光谱性质的不同进行分类，获得感兴趣荧光团以及自发荧光的空间分布后，再提取各个荧光团的纯光谱用于线性分离算法。通过在体模型实验和在体鼻咽癌肿瘤模型实验进一步验证了改进后线性分离算法的可行性。