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伊立替康(Irinotecan,IRT)在结构上属于喜树碱类衍生物;同时,它是一种前药,可以在体内羧酸酯酶(存在于血浆和多种组织中,比如肝脏,肿瘤等)的代谢下转化为活性代谢产物SN38;在作用机制上,伊立替康属于DNA拓扑异构酶Ⅰ(Top Ⅰ)的抑制剂,TopI参与细胞内DNA复制与RNA转录等过程,在肿瘤细胞中高表达,IRT及其活性代谢产物SN38可通过与Top Ⅰ的结合阻碍DNA的复制,导致细胞凋亡,因此对结直肠癌,乳腺癌,卵巢癌,肺癌等多种肿瘤均有抑制作用。IRT的抗肿瘤作用强弱十分依赖于其结构中内酯环的完整性:在pH<7的酸性环境中,IRT主要以内酯环形式存在,内酯环形式有抗肿瘤活性;在pH>7的偏碱性环境中,部分内酯环开环,失去抗肿瘤活性。目前,伊立替康的市售剂型是伊立替康的盐酸盐注射液,它水溶性好,但是静脉滴注给药会使药物直接暴露在pH 7.4的弱碱性环境下,导致IRT内酯环打开,活性降低,故需要增大给药剂量以期达到预期治疗效果;然而大剂量会导致一系列副作用(如严重腹泻、呕吐、中性粒细胞减少症和严重抑制骨髓细胞等);除此之外,喜树碱类药物属于时间依赖型药物,换言之,该类药物在体内滞留时间的延长对于药效的提高有着积极的意义。因此,寻找一种长效缓释的药物递送系统,对提高IRT疗效,降低其毒副作用是十分必要的。聚合物纳米粒(Polymeric Nanoparticles)作为一种新型纳米载药系统,具有许多优点:①它可以作为多种药物的载体,提高其生物利用度;②一些特殊材料的应用可使聚合物纳米粒具有长效、缓释的效果;③由于粒径合适,通常可以通过EPR效应被动靶向至肿瘤部位,提高药物的抗肿瘤效果。其中,以乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)为载体的聚合物纳米粒可通过骨架材料降解溶蚀达到缓释药物的目的,该骨架材料(PLGA)最终降解产物为水和二氧化碳,对人体无毒无害,已经被FDA批准为药用辅料。因此受到广泛的关注与研究。本课题以IRT为模型药物,以PLGA为载体材料,通过乳化-溶剂挥发法制备了一种伊立替康PLGA纳米粒(IRT-PLGA-Nps),主要研究内容包括:IRT-PLGA-Nps的制备及表征;IRT-PLGA-Nps的体外释药特性和初步安全性评价;IRT-PLGA-Nps在昆明小鼠体内药物动力学评价;IRT-PLGA-Nps在荷瘤小鼠体内药效学评价。1.IRT-PLGA-Nps的制备及表征首先,通过紫外分光光度法(UV)建立IRT的体外含量测定方法;其次,通过乳化-溶剂挥发法制备IRT-PLGA-Nps,并对可能影响IRT-PLGA-Nps包封率和载药量的处方因素进行筛选,对可能影响IRT-PLGA-Nps粒径的工艺因素进行筛选,确定最佳处方;最后,对最优处方进行重现并对其一系列理化性质进行表征,包括包封率,载药量,粒径,Zeta电位,pH,微观形态(TEM)和物相鉴定(DSC)。结果表明,在2.55～20.4 μg/mL浓度范围内,IRT在DMSO溶液中其吸光度与浓度之间的线性关系良好,该测定方法准确度好,精密度高,专属性强。通过单因素筛选,考察了工艺因素(包括剪切速度和剪切时间)对纳米粒粒径的影响,确定了最佳工艺为:剪切速度为25000rpm,剪切时间为3min;同时考察了处方因素对IRT-PLGA-Nps的包封率和载药量的影响,确定了最佳处方如下:药脂比为1:10,初乳水相中PVA浓度为1%,分散相中PVA浓度为0.5%,油水相体积比为1:3,水相分散相体积比为1:5;根据最佳处方工艺制备的IRT-PLGA-Nps其包封率为(52.22 ±2.41)%,载药量为(4.75 ±0.22)%,平均粒径为(169.97± 6.29)nm,Zeta 电位为(-1.75 ±0.20)mV,pH为(6.93 ±0.04),各批次间重现性良好。2.IRT-PLGA-Nps体外释药性和初步安全性评价为考察IRT-PLGA-Nps体外释药特性,给体内实验提供一定的参考,本实验采用动态膜透析法,以IRT-Sol为对照,考察IRT-PLGA-Nps的体外释药性和释放行为。通过紫外分光光度法测定不同时间点IRT-Sol及IRT-PLGA-Nps的药物释放量,计算药物不同时间点的累积释放百分率并绘制二者的释放曲线,用数学模型对释放结果进行拟合,分析IRT-PLGA-Nps的体外释放规律。此外,通过溶血试验对IRT-PLGA-Nps安全性进行初步评价,同时考察了 IRT-PLGA-Nps在血浆中的稳定性,为体内应用提供依据。结果表明,IRT在释放介质中,浓度在2.5～20μag/mL范围内,其吸光度与浓度之间线性关系良好,专属性、准确度及精密度均符合测定要求。与溶液组相比,纳米粒组表现出明显的缓释效果,IRT-S0l6h时累积释放百分率为(93.94±3.98)%;IRT-PLGA-Nps 12h累积释放百分率为(52.06± 1.65)%,192 h(8天)累积释放百分率超过97%,释放结果表明,IRT-PLGA-Nps开始释放较大量的药量,存在一定的突释现象,接着缓慢释放,维持一个较高的血药浓度,直至药物从IRT-PLGA-Nps中释放完全。数学模型拟合结果显示,IRT-Sol和IRT-PLGA-NPs的体外释放行为均符合Weibull方程,二者的拟合方程分别为 lnln(l/(l-Q/100))=2.18181nt-0.9604(r=0.9996)和Inln(1/(1-Q/100))= 1.13 93 lnt-1.8371(r=0.9941)。24h血浆稳定性试验结果表明,实验周期内,IRT-PLGA-Nps的平均粒径较为稳定,可满足注射要求;溶血实验结果显示,在20～100μg/mL浓度范围内,IRT-PLGA-NPs未出现溶血现象,溶血百分率小于5%,初步表明IRT-PLGA-NPs可安全用于静脉注射给药,为体内药物动力学实验和药效学实验提供了参考依据。3.IRT-PLGA-Nps的药物动力学评价为评价IRT-PLGA-Nps的体内缓释效果和药物动力学特征,本部分以普通KM小鼠为模型动物,对IRT-PLGA-Nps进行了药物动力学研究。首先,通过HPLC法建立了血浆中IRT(前药)及SN38(IRT的活性代谢产物)的含量测定方法;然后,以IRT-Sol为对照,测定给定时间点小鼠体内IRT和SN38的浓度,并绘制药-时曲线;最后,通过DAS 2.0软件分别计算IRT-PLGA-Nps和IRT-Sol进入体内后IRT和SN38的药物动力学参数,评价IRT-PLGA-Nps的动力学特点。方法学考察结果表明,在0.04～6.4μg/mL浓度范围内,IRT与SN38的血药浓度与峰面积之间线性关系良好,且该方法专属性高,准确度好,精密度高。药物动力学实验结果表明,经尾静脉注射给予IRT-PLGA-Nps和IRT-Sol后,IRT-PLGA-Nps组血浆中的IRT和SN38滞留时间均明显大于IRT-Sol组。首先,从对前药IRT的浓度测定结果来看,IRT-PLGA-NPs的t1/2 β,MRT和AUC值分别为IRT-Sol组的6.89倍,3.61倍和2.93倍;说明与溶液组相比,纳米粒组可以显著延长IRT在血浆里的滞留时间,提高IRT的生物利用度;其次,对代谢产物SN38的药物动力学参数进行分析,IRT-PLGA-NPs的t1 2 β,MRT 和 AUC 分别是 IRT-Sol组的 2.55 倍,4.43 倍和 2.31倍,同理,说明纳米粒组可以延长SN38在血浆里的滞留时间,有望使IRT的药效得到进一步提高。总体而言,IRT-PLGA-NPs可提高IRT及SN38在体内的滞留时间,这对于提高时间依赖型药物的药效而言是至关重要的。4.IRT-PLGA-Nps在荷瘤小鼠体内的药效学评价为系统地评价IRT-PLGA-Nps的药效,首先以荷H22肿瘤的KM小鼠为动物模型,以生理盐水为阴性对照,进行体内药效学研究,测定给定时间点的瘤体体积,绘制瘤体积-时间关系图,并计算抑瘤率(TGI)、肿瘤特定生长率(SGR)和肿瘤倍增时间(DT),量化地评价IRT-PLGA-Nps的体内抗肿瘤效果;同时,记录不同时间点各组小鼠体重,可通过实验周期内的体重变化间接评价IRT-PLGA-Nps的毒性。然后,取出荷瘤小鼠的肿瘤组织及主要脏器(心、肝、脾、肺、肾),进行HE病理学切片观察,通过观察肿瘤部位的切片,定性评价IRT-PLGA-Nps的抗肿瘤效果;通过观察主要脏器的切片评价IRT-PLGA-Nps的体内安全性。结果表明,实验周期内(18天),生理盐水组瘤体积呈现快速增长的趋势,IRT-PLGA-Nps 组的 TGI 是 IRT-Sol 组的 1.3 倍,SGR 是 IRT-Sol 组的 0.47 倍,DT 是IRT-Sol组的2.13倍,说明与IRT-Sol组相比,IRT-PLGA-Nps能更好地抑制肿瘤生长;同时,统计学数据结果(t-Test)显示,IRT-PLGA-Nps对小鼠体重无明显影响(p>0.05)(以生理盐水组为对照),说明本实验制备的纳米粒毒副作用较小。小鼠的肿瘤组织的HE切片结果表明,IRT-PLGA-Nps有显著的抑瘤效果;主要脏器HE切片各组无明显差异,表明IRT-PLGA-Nps对小鼠主要脏器无明显毒副作用,有一定的临床应用潜力。结论:本课题采用乳化溶剂挥发法制备了一种包封率高,载药量高,粒径适中的可静脉注射给药的IRT-PLGA-Nps,该IRT-PLGA-Nps体外释放缓慢,安全性及稳定性良好,药物动力学和药效学实验结果表明,IRT-PLGA-Nps可以延长IRT及其代谢产物SN38的体内滞留时间,抗肿瘤效果显著增强,毒副作用降低,为其临床应用奠定了 一定的基础。