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目的本实验通过模拟人类急性脑卒中的模型—大鼠大脑中动脉脑缺血再灌注模型(MCAO,middle cerebral artery occlusion),并运用Cathepsin L抑制剂Z-FY-DMK及Caspase-3蛋白抑制剂Z-DEVD-FMK分别进行干预,检测并分析脑梗死体积、脑缺血再灌注后不同时间点Cathepsin L与Caspase-3蛋白的表达变化,探讨Cathepsin L与Caspase-3蛋白在神经细胞凋亡中的相互关系。方法雄性健康清洁级SD(Sprague-Dawley)大鼠162只,生长周期约10-12周,体重约260-300g。按照随机数表法,将其分为假手术组(27只)和脑缺血再灌注组(简称模型组45只),抑制剂Z-FY-DMK组(简称CL干预组45只),抑制剂Z-DEVD-FMK(简称C-3干预组45只),假手术组按再灌注6h、12h、24h、48h分成4个亚组,每组6只大鼠(其中48小时组9只)。其余各组均按再灌注6h、12h、24h、48h分成4个亚组,每组10只大鼠(其中48小时组15只)。使用Longa线栓法制备局灶性右侧大脑中动脉梗死模型,缺血2h后拔除线栓即形成在灌注,假手术组大鼠线栓插入深度为8-10mm,其余操作同模型组;CL干预组与C-3干预组分别采用侧脑室穿刺法注射Cathepsin L特异性抑制剂Z-FY-DMK及Caspase-3蛋白抑制剂Z-DEVD-FMK(Z-FY-DMK:于MCAO前30分钟注射入右侧侧脑室,浓度为20ug/1ul,共5ul,留针10min;Z-DEVD-FMK:术前30min注射入右侧侧脑室10ul,浓度为0.5ug/0.5ul,留针10min,等量的DMSO溶液注射入假手术组和模型组于同一时间点及部位。)其中假手术组取3只大鼠,模型组48h和干预组48h均取5只大鼠行TTC染色。按通用的神经功能缺损评分方法(Longa,s5级评分法)评估神经功能缺损症状;采用TTC染色法、TUNEL法及Western blotting法,分别检测脑梗死体积、缺血侧大脑皮质神经细胞凋亡变化及Cathepsin L与Caspase-3的蛋白表达的变化。结果1.模型成功率88.24%;模型组48h相对梗死体积为38.25±1.06%,CL干预组48h相对梗死体积为26.00±1.414%,C-3干预组48h相对梗死体积为29±1.414%。2.TTC染色中,48小时组时间点的各组脑组织中,假手术组未发现病灶,模型组、CL组、C-3组的缺血侧下可见白色病灶,但CL组、C-3组相对梗死体积相对于模型组而言,明显减少(P<0.001),并且在CL干预组、C-3干预组的大鼠神经功能缺损症状与体征也发生了明显改善(P<0.05)。3.在脑缺血侧皮质区的凋亡细胞检测中,假手术组脑组织中凋亡细胞几乎很少见,模型组6h可见凋亡神经细胞,12h、24h、48h逐渐增多,呈上升趋势;CL干预组和C-3干预组在6h、12h、24h、48h观察到凋亡细胞与模型组对应时间点相比较,有明显下降(p<0.05)。4.在脑缺血侧皮质区的Western blotting检测相关蛋白中,假手术组的脑组织中可以检测到少量的Cathepsin L蛋白表达,模型组Cathepsin L蛋白,均在再灌注6小时开始上升,12h、24h达到高峰,48h仍保存高水平。与模型组比较,CL干预组与C-3干预组的Cathepsin L蛋白表达在各时间点均明显减弱(p<0.05)。5.在大鼠缺血侧皮质区,假手术组可以检测到少量的Caspase-3蛋白表达,模型组Caspase-3蛋白,均在再灌注6小时开始上升,24h达到高峰,48h仍保存高水平。与模型组比较,CL干预组与C-3干预组的Caspase-3蛋白表达在各时间点均明显减弱(p<0.05)。结论1.大鼠脑缺血再灌注损伤后,Cathepsin L介导的Caspases凋亡通路中,可能与Caspase-3蛋白存在相互制约的关系。2.Z-FY-DMK可通过特异性抑制Cathepsin L介导的凋亡级联反应,减少细胞的凋亡,减少脑梗死的体积。