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目的:从家蝇cDNA文库中筛选获得家蝇14-3-3ζ(MD14-3-3ζ)基因序列,对该序列及其编码蛋白进行分子特性分析,原核表达,初步探讨重组蛋白的抗菌活性及抗菌机制;检测MD14-3-3ζ基因在家蝇生活史中各龄期及3龄幼虫不同组织部位时空表达模式,初步探讨经大肠埃希菌诱导后,基因表达谱的变化,为进一步探讨其功能提供实验依据。方法:1、序列分析:采用生物信息学相关软件,对家蝇14-3-3ζ基因及其编码蛋白的基本理化性质、信号肽、二级结构等进行分析,预测蛋白质功能。2、cDNA克隆及原核表达:根据MD14-3-3ζ的cDNA序列设计引物,PCR扩增,构建pET-28a(+)-MD14-3-3ζ重组质粒,转入大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达产物的可溶性,通过镍柱纯化重组蛋白。3、Western blot及质谱鉴定:将纯化的MD14-3-3ζ蛋白免疫新西兰大白兔,获取多克隆抗体,Western blot鉴定重组蛋白;切下纯化蛋白的SDS-PAGE条带,送公司进行质谱分析鉴定。4、重组MD14-3-3ζ蛋白的抗菌活性检测及抗菌功能初探:采用微量液体稀释法,以大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌为指示菌,检测重组蛋白的抗菌活性;细胞内膜渗透性实验检测MD14-3-3ζ对大肠埃希菌细胞膜通透性的影响。5、MD14-3-3ζ基因时空表达模式的研究:1)收集家蝇生活史各发育阶段(卵、各龄期、蛹、成虫)的虫体及3龄幼虫不同组织(体壁、脂肪体、马氏管、中肠、唾液腺、气管),分别提取总RNA后并逆转录为cDNA,以家蝇RPS18为内参基因,对不同样本的MD14-3-3ζ基因表达情况进行实时荧光定量PCR(qPCR)检测,所有实验进行3个生物重复,每个样本重复实验3次。2)大肠埃希菌诱导后MD14-3-3ζ基因时空表达谱的变化:采用显微注射的方法将细菌注入家蝇2龄晚期幼虫,分别收集诱导后3 h、6 h、12 h、24 h、36 h、48 h虫体,qPCR检测不同时间点MD14-3-3ζ基因表达水平的变化,以注射PBS组为对照。结果:1、MD14-3-3ζ基因ORF全长771 bp,编码257个氨基酸,理论分子量29.35 kD;等电点4.87,属于亲水性的酸性蛋白,含有多种酶的结合位点,有14-3-3家族结构域和活性位点,定位于细胞核中,二级结构以α螺旋和无规则卷曲为主。2、成功构建MD14-3-3ζ原核表达载体,IPTG诱导后,上清可溶表达重组蛋白,经镍柱纯化,获得纯化的MD14-3-3ζ重组蛋白。3、Western blot结果显示,得到与预计条带大小相符的清晰条带;质谱分析显示,重组蛋白序列与MD14-3-3ζ序列一致。4、体外抗菌试验结果:MD14-3-3ζ蛋白对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌均有抑制作用,MIC(minimal inhibitory concentration)值分别为0.16 mg/mL、0.25mg/mL。细胞内膜渗透性实验显示,随着MD14-3-3ζ作用时间的延长,A430nm值从0.1左右上升至0.7,随着时间的延长而增加。5、时空表达模式研究:1)在不同发育时期,以卵期为参照,该基因在成虫中表达量最高,表达量为成虫>2龄幼虫>蛹>1龄幼虫>3龄幼虫>卵,成虫比卵期上调了141.773倍(P<0.05),2龄幼虫则上调了79.7967倍(P<0.05);在3龄幼虫不同组织中,该基因在体壁表达量最高,其次为气管(P<0.05)和唾液腺(P<0.01)。2)注射感染大肠埃希菌后,以PBS组为对照进行计算,表明注射感染大肠埃希菌后3 h,MD14-3-3ζ基因出现明显的上调,上调了14.704倍(P<0.05),其次为24 h,上调了2.503倍。36 h、48 h为下调趋势(P<0.01)。结论:1、本研究对家蝇14-3-3ζ基因进行了分子特性分析,体外克隆、表达,获得并鉴定了MD14-3-3ζ重组蛋白;该重组蛋白在体外对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌均有抗菌效果,对大肠埃希菌抗菌活性较好;并能改变其细胞内膜的通透性。2、MD14-3-3ζ基因在家蝇不同生长时期及3龄幼虫不同组织中均有表达,经大肠埃希菌诱导后,该基因的表达量在3 h出现了明显的上调,提示该基因参与了家蝇的免疫防御过程。