论文部分内容阅读
光学纯扁桃酸及其相关衍生物是合成多种重要医药中间体的关键手性砌块,如R-扁桃酸用于合成头孢菌素,抗肿瘤化合物,抗肥胖化合物等;R-邻氯扁桃酸用于合成抗血小板聚集药物氯吡格雷。立体选择性α-羟酸脱氢酶能够选择性的氧化外消旋α-羟酸的一个异构体,达到拆分的目的,为生产光学纯扁桃酸及其相关衍生物的重要途径。论文首先建立了两种立体选择性α-羟酸脱氢酶快速显色的高通量筛选模型。筛选模型Ⅰ基于外消旋扁桃酸在扁桃酸脱氢酶的作用下会产生酮酸的性质,利用2,4-二硝基苯肼进行衍生化,两者会发生明显的显色反应,验证了该显色法测定产物浓度和菌株选择率的准确性。筛选模型Ⅱ基于苯丙酮酸/Fe3+能在在冰醋酸和二甲基亚砜的水溶液中形成蓝绿色配合物的性质,建立了能筛选选择性氧化苯基乳酸的α-羟酸脱氢酶的快速筛选模型,确定了该筛选模型的最佳反应体系和条件。利用以上模型,从土样中筛选出了具有较高扁桃酸脱氢酶活性的菌株ZJB-1101和ZJB-1125,经形态观察、生理生化试验、16S rRNA序列及系统发育分析,菌株ZJB-1101和ZJB-1125分别鉴定为Sinorhizobium s和Pseudomonas aeruginosa。比较了两菌株热稳定性、比生长速率的理化特性,菌株静息细胞中所含的扁桃酸脱氢酶的辅酶类型,为非NAD(P)+依赖型。比较了菌株Sinorhizobium sp.ZJB-1101和Pseudomonas aeruginosa ZJB-1125 对各种不同底物的选择性,反应时间和底物e.e.值情况,其中两菌株对各个底物均具有较高的催化活性和立体选择性,反应结束后e.e.值均在91%以上,对各底物都是S型选择性,R底物的收率均在45%以上。且两株菌催化对位不同取代基底物时符合取代基效应的Hammett方程,反应常数ρ分别为1.2679和0.9749。同时测定了菌株Sinorhizobium sp.ZJB-1101对几种底物的表观米氏常数。以Pseudomonas aeruginosa ZJB-1125为出发菌株,通过单因素法和正交实验,得出了菌株最佳的扁桃酸脱氢酶产酶条件的培养基组成是:邻氯扁桃酸2.5 g/L、甘露醇10 g/L、酵母浸出粉10 g/L、K2HP04·3H20 2.5 g/L、KH2P042.5 g/L、CuC12 0.01 g/L、NaCl 1 g/L,进一步对菌株的其它发酵条件进行了考察,发现培养基初始pH调至7.0对菌株发酵产酶最有利,接种量为4%(v/v)时菌株产酶最好。在上述条件下,菌株的产酶26.48 U/L,是原始培养条件时5.20 U/L的5.1倍。菌株Pseudomonas aeruginosa ZJB-1125的静息细胞催化拆分底物时,发现当转化液体系pH为7.5时,酶活力达到最大,在底物浓度为30 mM时酶促反应有最大的反应初速度6.79 μmmolmin-1gDCW-1,当继续增大底物浓度时表现出抑制效应,反应速度下降较快。该菌体静息细胞中的酶嗜热,最佳反应温度为50℃;该菌体催化反应在20-50℃范围内符合Arrhenius方程,表观活化能Ea=26.81 kJ/mol;且该菌体在35℃和45℃时半衰期分别为35.8 h和26.4 h。静息细胞的使用批次较差,在第5个批次时,初速度只有第一次使用时的11%,高溶氧有利于静息细胞的催化反应,动力学参数方面,在低底物浓度下,表观米氏常数为Km=6.47 mM,表观最大反应初速度Vmax=0.103 mM/min。