新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）是一种有囊膜、含有单股负链不分节段基因组的RNA病毒,其基因组至少编码六种病毒蛋白。基质蛋白（matrix protein,M）是NDV基因组编码的一种非糖基化膜相关蛋白,位于病毒囊膜内表面,构成病毒核衣壳蛋白和囊膜连接的支架。与大多数副黏病毒M蛋白一样,NDV M蛋白是一种多功能病毒蛋白,同时也是一种细胞核-细胞质穿梭蛋白。本课题组前期通过荧光共定位试验发现importinβ1蛋白缺失体与NDV M蛋白共表达后导致M蛋白不能进入细胞核,并且免疫共沉淀试验发现importinβ1蛋白能与M蛋白发生相互作用,暗示importinβ1蛋白可能是NDV M蛋白入核转运的核转运受体蛋白。由于免疫共沉淀试验不能反映蛋白之间的直接相互作用,因此需要进一步用其它试验来验证。目前,pull-down技术被广泛应用于蛋白质之间在体外的直接相互作用研究。因此,本研究通过构建NDV M基因和鸡importinβ1基因的重组原核表达载体,利用原核表达系统获得重组蛋白,然后通过GST pull-down技术验证NDV M蛋白与鸡importinβ1蛋白之间的相互作用。1鸡importinβ1基因的克隆与序列分析根据Gen Bank登录的鸡importinβ1基因序列（XM₀15299473）设计合成特异性引物,通过RT-PCR从DF-1细胞中扩增importinβ1基因CDS区并进行克隆和测序,利用生物信息学工具对其理化性质、二级结构、亚细胞定位和系统进化树进行分析。结果表明,鸡importinβ1基因CDS全长2268 bp,共编码755个氨基酸,编码的蛋白等电点为4.61,相对分子质量84.15 k Da,分子式为C3712H5901N979O1152S46。蛋白质二级结构预测显示,鸡importinβ1蛋白含有丰富的二级结构,以α螺旋为主（占64.90%）,亚细胞定位预测发现该蛋白定位于细胞质。importinβ1基因同源性及系统进化树分析结果表明鸡与鹌鹑的亲缘关系最近。2鸡importinβ1基因重组原核表达载体的构建与表达本研究以重组质粒p CR2.1-importinβ1为模板,用鸡importinβ1基因的特异性引物进行PCR扩增,胶回收目的基因并将其亚克隆至原核表达载体p ET-32a（+）,构建重组原核表达载体p ET-32a-importinβ1。将测序正确的重组原核表达载体p ET-32a-importinβ1转化大肠杆菌BL21（DE3）,对IPTG浓度、诱导温度和诱导时间进行优化,以确定重组蛋白的最佳表达条件。结果表明,成功构建重组原核表达载体p ET-32a-importinβ1,经IPTG诱导表达及条件优化,确定当IPTG终浓度0.1m M、温度37℃、诱导时间4h时目的蛋白的表达量最高,并且在大肠杆菌中的目的蛋白分子量约为97 k Da,与预期大小相一致。对目的蛋白表达形式研究结果发现,His-importinβ1重组蛋白以可溶性和包涵体形式存在。3 NDV M基因重组原核表达载体的构建与表达本研究以实验室保存的重组质粒p CMV-HA-M为模板,利用NDV M基因特异性引物进行PCR扩增,胶回收目的基因后进行双酶切,然后将其与经过同样双酶切的原核表达载体p GEX-6p-1连接,转化大肠杆菌,提取质粒进行酶切鉴定,以此构建重组原核表达载体p GEX-6p-M。将测序正确的重组原核表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株,对IPTG浓度、诱导温度和诱导时间进行优化,以确定最佳表达条件。结果表明,成功构建重组原核表达载体p GEX-6p-M,经IPTG诱导表达及条件优化,确定当IPTG终浓度0.1m M、温度37℃、诱导时间5h时目的蛋白的表达量最高,并且在大肠杆菌中的目的蛋白分子量约为68 k Da,与预期大小相一致。对目的蛋白表达形式研究结果发现,GST-M重组蛋白主要以包涵体形式表达。4 GST Pull-down验证NDV M蛋白与鸡importinβ1蛋白的相互作用本研究对包涵体GST-M重组蛋白首先进行变性和复性处理,以获得有活性的GST-M重组蛋白。然后以GST-M重组蛋白为诱饵蛋白,His-importinβ1重组蛋白为猎物蛋白,利用GST pull-down技术验证M蛋白与importinβ1蛋白的相互作用。结果表明,利用蛋白重折叠试剂盒获得了有活性的GST-M重组蛋白,将其作为诱饵蛋白,可以捕获并检测到His-importinβ1重组蛋白,但是GST标签蛋白不能结合His-importinβ1重组蛋白。以上结果说明GST pull-down技术证实NDV M蛋白与鸡importinβ1蛋白在体外具有直接的相互作用,这为深入研究importinβ1蛋白在NDV M蛋白细胞核定位的分子机制以及在NDV复制和致病中的作用奠定了基础。