鸭病毒性肠炎McAb-ELISA检测方法的建立与应用

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鸭病毒性肠炎(DuckViralEnteritisDVE)是鸭、鹅和其他雁形目禽类的一种急性、热性、败血性传染病。用辛酸-饱和硫酸铵方法纯化本室已制备的DEV单抗腹水,经酶联免疫印迹试验鉴定此株单抗可以与69kD的DEV结构蛋白特异性结合;非竞争ELISA方法测定其亲和力常数为1.17×1011。 以此单抗为基础,建立双抗体夹心ELISA方法检测DEV抗原。对反应条件进行优化,结果显示:包被单抗、鸭抗DEVIgG和酶标羊抗鸭二抗分别稀释4000倍、400倍和3000倍,加入的封闭液、被检抗原、鸭抗DEVIgG、酶标羊抗鸭二抗和底物溶液分别作用60min、60min、60min、90min和15min时试验效果最好;经交叉试验、敏感试验及重复性试验验证,该系统特异性强,敏感性较高,阴阳性样品的变异系数(CV)均小于5%;与PCR试验结果比较,该方法的敏感性为100%,特异性为85%,符合率为88%。通过对临床样品的检测,确定心脏和脾脏是其最佳检出器官。该方法的建立与应用对DEV的临床检测具有重要的实际意义。 以DEV作为包被抗原,利用待检血清和本株单抗腹水纯化物竞争这一抗原,建立竞争ELISA方法检测DEV抗体。经研究确定:DEV抗原包被浓度为7.5μg/ml,1%明胶封闭30min后,加入50倍稀释待检鸭血清与1000倍稀释的纯化单抗溶液的等量混合物,作用60min,酶标羊抗鼠IgG的工作浓度为1:10000,作用60min,底物作用15min后终止反应。研究表明,该方法特异性强,稳定性好。应用该方法检测临床免疫种鸭的抗体水平,并作实验室攻毒保护试验。结果显示,免疫抗体抑制率高低与攻毒保护率的高低有一定的相关性,抗体抑制率大于40%时,可完全保护。该方法可用于鸭瘟流行病学普查和免疫抗体检测,以便能及时正确的了解鸭群的健康状况和免疫抗体水平,指导制订科学合理的鸭瘟免疫程序。
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