花粉管的极性快速生长对于植物的有性生殖是至关重要的。花粉管的极性生长受到诸多因素的调节,例如钙离子信号、小G蛋白、细胞骨架和花粉管细胞壁的组成结构。其中的花粉管细胞壁多糖组分的定位,对于花粉管的生长十分重要,而多糖组分的运输又依赖于囊泡运输过程的介导。COG复合体是含有八个亚基一类囊泡栓系因子,在哺乳动物和酵母细胞中,COG复合体在高尔基体潴泡间的囊泡逆向运输过程中发挥着栓系的功能。但在植物细胞中,只有COG7功能得到初步解析。在拟南芥中,COG7影响着胚胎后期的发育进程。在本论文研究中,我们通过反向遗传学手段,分离获得了拟南芥COG复合体COG3亚基的T-DNA插入突变体。证明了 COG3在花粉管的极性快速生长中发挥着重要的功能。1- COG3影响花粉管的生长,从而阻断雄配子体的传递我们在对cog3突变体植株进行繁种的过程中,发现植株的后代中没有纯合体株系,而所产生的野生型和杂合体株系的分离比大致为1:1,因此怀疑突变体植株的配子体传递出现了问题。进一步的遗传学分析结果显示:在cog3突变体中,雄配子体的传递被完全阻断,而雌配子体的传递并未受到明显的影响。基因表达的时间和位点通常预示着其功能,我们通过GUS染色实验发现COG3基因在花粉发育的二核时期开始表达,并随着发育时间的延长,表达量逐渐升高,并且在花粉管和胚胎中也有表达。为了便于比较野生型和突变体花粉粒之间的差异,我们将突变体花粉粒导入到qrt1的背景下,亚历山大染色、DAPI染色以及扫描电镜的观察结果显示:突变体中,花粉的活性、细胞的发育以及花粉外壁的结构均未受到影响。随后,花粉体外萌发实验证明:突变体和野生型花粉粒的萌发率没有明显差异,但突变体花粉粒萌发出来的花粉管形态异常,主要包括以下几种类型:统计表明花粉管生长畸形(25%)、花粉管爆裂(26%)和花粉管生长受到限制(4%),异常花粉管的比率接近50%。我们又在qrt1的背景下,做了花粉体内萌发实验,野生型花粉粒在雌蕊的柱头上可以萌发出3-4根正常的花粉管,而突变体花粉粒最多只能萌发出两根正常的花粉管。为了证实所观察到的突变体雄性不育的表型,的确是由COG3基因的突变所导致,我们将花粉特异性启动子LAT52驱动COG3-GFP表达的质粒转入cog3突变体,并成功回补了其雄性不育的表型。通过荧光观察,发现COG3蛋白定位在高尔基体上。因此,我们得出结论:COG3基因的突变影响花粉管的生长。经过转基因回补之后,我们仍然得不到cog3纯合突变体株系。观察回补植株的长角果,我们发现长角果中有生长明显滞后的胚胎,推测其可能为cog3纯合体。因此,COG3同样影响着胚胎的发育。2. COG3影响高尔基体的结构及高尔基体内的囊泡的逆向运输在哺乳动物和酵母细胞中,COG3基因的敲除,会导致细胞中的高尔基体潴泡出现断裂,潴泡中的驻留蛋白的定位出现异常。我们想知道在植物细胞中是否有类似的情形发生。首先我们使用了荧光观察的方法,比较突变体和野生型细胞中的高尔基体marker蛋白(GAU14-GFP和GFP-EMP12)标记的Golgi的形态差异,结果显示:和野生型细胞中棒状的Golgi形态相比,突变体细胞中的高尔基在形态上更趋向于球形结构(荧光的长宽比降低了),这说明在突变体细胞中,高尔基体形态结构发生了改变。我们使用了高压冷冻取代切片技术,进一步观察cog3花粉粒中的高尔基体形态结构。74%的突变细胞中高尔基体潴泡的垛堞数和野生型相近,但高尔基体潴泡宽度变短,潴泡间的间距变大,几乎分不清高尔基体潴泡的极性;另外26%的高尔基体结构不完整,只剩下少量的垛堞。我们使用EMP12蛋白作为marker来研究突变体中Golgi驻留蛋白的极性定位是否发生了改变,我们发现原本定位在Golgi顺面和中间潴泡的EMP12蛋白,在突变体细胞中分散到Golgi的各个垛堞,失去了其定位的极性。以上结果说明:类似于哺乳动物和酵母细胞,植物细胞中的COG复合体参与了高尔基体形态结构的维持,并在囊泡的逆向运输过程中发挥着作用。3. COG3影响花粉管细胞壁部分多糖组分的定位植物细胞中的高尔基体是分泌途径的分选中心也是合成细胞壁多糖组分的场所。我们通过化学染色以及免疫荧光的方法观察了花粉管中细胞壁的形态特征。结果显示:花粉管细胞壁中的纤维素的分布情况和野生型相比没有明显的差别,但甲酯化果胶和去甲酯化果胶的定位都出现了异常。而本应该定位在花粉管侧壁的胼胝质,在花粉管的顶端也有分布。甲酯化果胶、去甲酯化果胶及胼胝质定位的错误,改变了花粉管细胞壁的硬度分布状况,使得花粉管出现了各种异常的形态:爆裂、畸形和生长受限制。因此,我们得出结论:COG3基因通过改变花粉管细胞壁部分多糖组分的定位,而影响了花粉管的形态结构,进而导致了植株的雄性不育。4. COG复合体的组织结构在动物细胞和酵母中,COG复合体由8个亚基所构成,呈两个小叶状的结构。在动物细胞中,COG2/3/4构成了一个小叶,COG5/6/7组成了另一个小叶,COGI和COG8亚基作为结构的核心组织者,负责将两个亚复合体连接在一起。酵母中的COG复合体则由COG1亚基作为结构核心,将COG2/3/4和COG5/6/7/8两个亚复合体连接在一起。在本实验中,我们通过双向酵母双杂交实验,得到了植物COG复合体的初步组织结构。和动物细胞中的COG复合体结构相比,植物细胞中的COG复合体同样是COG2/3/4亚基构成一个小叶,COG5/6/7构成了另一个小叶,所不同的是,在植物细胞中还存在着COG3/5/8这3个亚基之间的互作。COG3/5/8可能构成了植物COG复合体的结构核心。