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背景VWF是一种粘附性的多结构域的血浆蛋白,在凝血过程中发挥重要作用。当血管破裂时大量血小板以VWF为中介,粘附在胶原纤维上,从而形成血栓,得以止血。VWF血浆水平、结构和功能等方面的异常与一系列心血管疾病如动脉粥样硬化等关系密切。当VWF基因发生缺失、插入点突变等情况时,导致血浆VWF量有显著降低或有质的缺陷,不能完成其正常的血液学功能时,即血管性血友病（VWD）。VWF主要由内皮细胞和骨髓巨核细胞合成,前者产生后多储存在韦伯小体（WPB）内,后者则储存在血小板的颗粒中。VWF分子由复杂的多结构域组成,其单体共有14个结构域。由不同数量的VWF单体形成了大小不一的VWF多聚体。据目前的报道,在VWF多聚体组装中,由VWF单体的C端即尾部CTCK结构域中的半胱氨酸（Cys 2771,Cys 2773,Cys 2811）以分子间二硫键二聚化两个VWF单体形成束状结构,介导VWF二聚体的形成;其次,二聚体中VWF单体的N端即头部D结构域中的半胱氨酸（Cys 1099,Cys 1142）与其他的二聚体中D结构域的半胱氨酸（Cys 1099,Cys 1142）以分子间二硫键组装,从而将VWF二聚体串联起来,形成大的VWF多聚体。在正常生理状态下,VWF多聚体大小由血浆金属蛋白酶ADAMTS13来调节:ADAMTS13在VWF分子中唯一的一个酶切位点位于氨基酸1605-1606（VWF的A2结构域）。当VWF分子以超大型多聚体（ULVWF）的形式被细胞分泌出来时,这种ULVWF在血液剪切应力的作用下,容易暴露其A2结构域。而血液中循环的ADAMTS13会对ULVWF分子进行酶切,这种酶切有随机性,ULVWF被分解成大小不同的VWF多聚体。VWF多聚体经酶切后的产物,在还原性SDS-PAGE结果中可显示出VWF单体（～290 kDa）、C-末端（～170kDa）及N-末端片段三条条带。实际上根据线性模型,对给定长度的VWF分子经ADAMTS13酶切后产生的末端片段可以进行理论预测。随着ADAMTS13切割VWF次数越少,形成的VWF分子量越大,并且形成的末端片段与全长VWF单体的理论摩尔比越小。然而在我们对不同的人的血浆来源的VWF进行分析时发现,部分人的末端条带与VWF单体的理论与实际灰度值的差异,VWF分子携带的ADAMTS13切割末端片段所占比高于理论预期,即实际的灰度值之比高于理论值之比,这是VWF线性结构模型无法解释的现象。因此上述分析表明,VWF当前的线性结构模型或许不能完全代表其在生理环境中的真实结构。目的本课题中,探究VWF的结构模式,深入分析多分支、少或无分支的VWF结构可能在功能上的差异。有助于完善VWF结构方面的研究内容及不同分子结构的VWF在功能上存在的差异,为VWD相关血液疾病中的诊断与治疗提供一定的依据。研究方法1.纯化并分析人的血浆VWF按照分子量大小进行蛋白样品收集,我们分别获得富集高分子量和富集低分子量的VWF蛋白。根据多聚体凝胶的条带统计的灰度值以及VWF线性模型所预测的理论摩尔数之比,通过加权平均公式统计,得到了理论上的末端片段与VWF单体的灰度值之比;根据还原条件下,蛋白质免疫印迹结果中末端条带与VWF单体的实际灰度值比的统计,我们分析了末端片段与VWF单体的理论和实际灰度值的差异。2.人来源的血浆VWF凝血功能的差异利用血小板聚集实验来研究,结构不同的VWF在凝血功能方面的差异。3.构建不同结构域的蛋白及其突变蛋白为了判断VWF分支结构具体出现的位置,我们将全长VWF缩小结构域的范围,将VWF分为两部分,构建了前部分为V（1-1493 aa）代表VWF单体N-端,后部分为WF（1494-2813 aa）代表VWF单体C-端的质粒。分析表达蛋白在还原和非还原条件下,蛋白质免疫印迹上条带的分布情况。根据实验结果,继续构建Ⅴ片段的单点突变和双突变（Cys 1099 Ser,Cys 1142 Ser,Cys 1099/1142 Ser,Cys 1126 Ser,Cys 1099/1126 Ser,Cys 1126/1142 Ser）,以探究VWF分支结构具体出现的位置。然后,我们进一步缺少D1D2结构域的成熟Ⅴ片段（Mature-Ⅴ）,D’D3片段,D1D2D’D3片段（D1D3）及其单点突变（Cys 1099 Ser,Cys 1142 Ser）等来确定不同结构域对V片段高聚形式产生的影响。4.研究高聚形式对FⅧ:C活性的影响利用镍柱等蛋白质纯化技术纯化目标蛋白,并通过蛋白质免疫印迹等进行验证及定量。对VWF敲除（Vwf-/-）小鼠分别注射目标蛋白,利用FⅧ:C试剂盒进行检测小鼠血浆中FⅧ:C活性的变化差异。5.电镜观察纯化的人血浆蛋白VWF与上海国家蛋白质中心合作,利用透射电子显微镜观察人血浆VWF形态结构。研究结果1.VWF新的结构模型的提出我们提出了符合末端片段占比高这一现象的模型---VWF分支状模型。在分支模型中,VWF单体间二硫键的的形成数量和位点增多,形成多个分支节点,从而增加末端片段所占的比例,因此符合实际统计结果中末端片段。2.电镜下观察到VWF分支结构在透射电子显微镜下,我们收集了部分VWF电镜数据,VWF呈现分支结构。3.多分支的VWF凝血效果更强高分子量VWF中,根据多聚体凝胶统计的末端片段与VWF单体的理论比值和蛋白质免疫印迹统计的末端片段与VWF单体的实际比值,将末端片段所占比相对较大的定义为多分支的VWF;末端片段所占比相对较小的定义为少分支的VWF。表明,血小板对多分支VWF比少分支的VWF反应更敏感,血小板凝集迅速且程度更高。4.VWF的N-端片段可能存在高聚形式为了判断VWF分支具体出现的位置,我们缩小VWF结构域的范围,构建重组质粒,筛选建立稳定细胞系,并对分泌蛋白进行验证。Ⅴ片段观察到三聚甚至四聚体大小的条带存在。而在线性模型中,VWF末端只能形成二聚体形式,不能形成三聚或寡聚,因此V片段可能存在分支结构。5.具有高聚形式的Ⅴ片段对FⅧ活性影响更迅速结果表明,含有高聚形式的V片段比高聚形式大大降低的Cys 1099/1142 Ser双突变体对FⅧ的保护作用更加迅速。6.Cys 1126可能参与形成分子间二硫键的形成,且D1D2和A1结构域对V片段的高聚形式的形成有一定影响单突变1126位点的半胱氨酸时,Ⅴ片段仍能形成三聚以上的高聚形式,而同时进行Cys 1099/1126 Ser和Cys 1126/1142 Ser双突变时,高聚形式大大降低,说明Cys 1126很有可能是VWF的N-末端除了 1099和1142位点的半胱氨酸以外的参与VWF单体间二硫键形成的半胱氨酸。为了进一步确定不同结构域对高聚形式形成的影响,而构建缺失D1D2结构域片段,定义为成熟Ⅴ片段,成熟Ⅴ片段不再形成聚合形式,说明D1D2结构域对多聚的形成有促进作用。进一步缺失A1结构域后,仅有D’D3片段情况下,更易形成高聚形式,则说明A1结构域可能阻碍其高聚的形成。结论（1）我们提出符合统计结果的VWF新的结构模型---VWF分支状结构模型。（2）在电镜下观察到VWF的分支状结构,支持了我们分支结构的合理性。（3）功能方面:多分支VWF分子跟少支VWF分子相比,对凝血反应更敏感。（4）结构方面:VWF单体间形成分子间二硫键的位置存在于VWF的N-末端的D结构域和C-末端的CTCK结构域,当我们把VWF分子从中间分开时,我们发现含有D结构域的重组片段可以形成多聚体,而含有CTCK的重组片段只能形成二聚体,从而说明VWF存在于N-端的分子间二硫键对分支结构起主要作用。同时,含有高聚体的V片段与高聚体大大降低的Ⅴ片段的双突变体Cys 1099/1142 Ser相比,Ⅴ片段可能使FⅧ:C活性保护得更加迅速。（5）为了进一步探明VWF分支结构的分子基础,我们对可能影响分子间二硫键的氨基酸进行突变以及对不同结构域进行缺失等,结果表明:1126位点半胱氨酸,以及D1D2结构域可能参与形成VWF分支结构。