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导师汪受传教授领衔研制的金欣口服液在前期临床和实验研究中均被证实是抗RSV感染的有效中药复方。本课题前期研究成果已表明金欣口服液能调控RSV感染活化诱导的TLR4及下游信号分子的表达水平。鉴于中医药作用的多靶点性,本实验从干扰TLR4表达入手,探讨RSV感染时金欣口服液对TLR4信号通路的调控,及与其它TLRs的相关性。目的本实验主要研究目的是干扰TLR4表达,分析金欣口服液对TLR4信号通路下游相关蛋白的影响,旨在进一步阐明金欣口服液通过免疫调节治疗小儿呼吸道合胞病毒肺炎的分子生物学机理。方法本实验采用小分子RNA干扰技术,TLR4-siRNA和脂质体Lipofectamine2000复合物转染RAW264.7细胞,Realtime RT-PCR法检测TLR4mRAN转录水平,确定siRNA干扰效率。RAW264.7细胞TLR4表达被干扰后,以RSV感染,再采用金欣口服液含药血清处理,收集细胞,Realtime RT-PCR、Western blot法检测TLR4及其信号通路关键分子TRIF、 NF-κB mRNA和蛋白的表达变化。结果1.体外化学合成的TLR4siRNA,经脂质体Lipofectamine2000转染RAW264.7细胞后,能有效干扰TLR4的表达,其mRNA表达抑制率达57.4%(P<0.05)。2.TLR4的表达干扰后,TLR4信号通路下游信号分子NF-κB mRNA及蛋白的表达亦降低(表达抑制率25.8%)(P<0.05)。但抑制率低于TLR4,表明NF-κB的表达还受其它TLRs调控,从而说明TLR4信号通路只是RSV感染后的一个通路。3.TLR4的表达干扰后,TRIF mRNA及蛋白的表达却明显上升(表达上升1.835倍)(P>0.05)。表明TLR4与TRIF之间存在负调控关系,亦有可能与TLR3协同作用。同时说明RSV感染后,可激活TLR4/TRIF/NF-κB信号通路。4.金欣口药血清上调RSV感染后的TLR4、NF-κB mRNA和蛋白的表达(P<0.05),但对TRIF mRNA和蛋白的表达无明显调控作用(P>0.05)。结论1.TLR4siRNA能有效干扰TLR4的表达。2.金欣口服液是治疗RSV感染的有效药物,其作用不仅仅通过调节RSV诱导的TLR4/NF-KB信号通路实现的,同时也依赖其他TLRs信号通路,但是不经过TLR4/TRIF途径。而金欣口服液亦可通过其它通路调控下游信号分子生成,体现了中药复方发挥作用的多靶点效应。