三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)是我国最主要的淡水珍珠贝。在珍珠养殖过程中,外套膜小片移植手术,即插片手术,是十分重要的技术环节。插片手术后,经过一系列的免疫反应,外套膜小片形成珍珠囊,珍珠在珍珠囊里形成。同时,手术也会对育珠贝造成很大的伤害,甚至会因为感染而死亡。如何采取有效管理措施缓解外套膜小片与育珠贝间免疫排斥反应,降低插片手术以后育珠贝受细菌等病原微生物感染率,成为提高珍珠质量和产量的重要课题。目前,外套膜小片移植手术后,育珠贝和外套膜小片的免疫生理过程仍不清楚。免疫基因的表达变化可反映免疫生理过程,具有指示作用。凝集素是重要的模式识别受体可识别多种病原微生物及其他异物,调控后续系列免疫反应。本研究从三角帆蚌体内鉴定出了2个半乳糖凝集素基因(Galectin),对它们的结构和功能进行了全面而系统的研究,并分析了2个基因在育珠移植免疫过程中的指示作用,揭示了生理反应关键点,以期为育珠生产过程中及时采取有效处理措施提供理论依据。得到了以下研究结果:1.两个半乳糖凝集素基因的cDNA全长序列的克隆及结构分析我们克隆获得2个半乳糖凝集素基因,分别命名为HcGal1和HcGal2。HcGal1基因的cDNA序列全长为1917 bp,其中包括140bp的5’端非翻译区(UTR),838bp的3’端非翻译区,以及939 bp的开放阅读框,编码了312个氨基酸。包含2个CRD。预测HcGal1的蛋白分子量和理论等电点分别为35.5kDa和9.54,没有信号肽。HcGal2基因的cDNA序列全长为797 bp,包括80 bp的5’端UTR,267 bp的3’端UTR,以及450 bp的开放阅读框,编码149个氨基酸。包含1个CRD。预测的蛋白分子量和理论等电点分别为17.2kDa和7.82,没有信号肽。2.两个半乳糖凝集素基因组织表达分析荧光定量PCR检测发现,2个基因的mRNA在三角帆蚌各个组织中都有表达,其中HcGal1在血细胞中表达最高,血液是三角帆蚌重要的免疫组织,而HcGal1基因在血细胞中的高表达可以初步推测其发挥着重要的免疫作用。HcGal2在外套膜中的表达量最高,外套膜是贝类免疫的第一道防线,这也表明HcGal2发挥着重要的免疫作用。Western blot分析表明,2个基因在蛋白水平的表达与mRNA的表达不一致,推测是由于mRNA的转录后调控造成,即机体会根据自身的需要以降解的方式清除不需要表达的mRNA,或者是通过改变mRNA的半衰期等来控制基因表达的程度以及蛋白产物的生产。3.两个半乳糖凝集素基因细菌诱导后的相应表达2个基因在血细胞、外套膜、肝脏经革兰氏阴性菌、阳性菌刺激后均呈现显著性上调的趋势,表明HcGal1和HcGal2可以起到抑菌、杀菌的作用,从而达到清除病原菌的目的。并且HcGal1和HcGal2在不同组织中对于不同细菌的效应时间有所不同,说明HcGal1和HcGal2在不同的组织中对于每种细菌的敏感度是有所不同的,原因可能是由于两个基因的CRD结构域的不同,使得它们对不同细菌表面的糖类的识别与结合能力有所不同。4.两个半乳糖凝集素基因蛋白水平的功能研究原核表达出了2个基因的重组蛋白,细菌凝集实验显示2个基因的蛋白均能够凝集一些菌种,表明2个基因均能够识别并且抵御病原微生物的入侵。将2个基因的重组蛋白注射到蚌体后,检测血细胞对异物的吞噬效率,结果显示注射了重组蛋白的血细胞吞噬效率比对照组显著性地增强,表明2个基因的重组蛋白能够促进血细胞的吞噬作用,从而杀死病原菌。5.育珠移植免疫生理过程指示作用研究插片手术以后,2个基因在被检测的各个组织中呈现了不同的表达模式,推测HcGal2基因对于“非己”物质有强烈的免疫排斥反应。而HcGal1基因则可能是参与了机体的负反馈调节,通过降低mRNA水平减小机体对异物的排斥而使移植小片不脱落。另外,根据基因的表达变化以及对珍珠囊形成过程的肉眼观察,可将插核后移植免疫分为3个关键生理期,即静歇期(0-24 h),伤口愈合和珍珠囊形成期(24 h-7 d)和珍珠形成期(7天以后)。通过基因在这几个时期的表达变化,可以在我们生产上起到生理指示作用,研究免疫基因的表达与插片手术后机体的生理反应之间的关系,及时的对养殖环境做出调整,以降低蚌体的感染率和脱片率,提高成活率和珍珠质量。