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目的:法医物证检验涉及到最常见的生物检材之一是精液和阴道液混合斑,从混合斑中分离出男性的特有成分精子是目前性犯罪案件的难点。针对混合斑分离精液和阴道液组分进行检测以及精液特有成分检测的方法有多种,但是有时会因为女性成分如阴道上皮细胞数量远多于精子数量,造成了获得精子难度提升,或者即使获得但是精子不完整或者并非单一成分,这导致后续提取精子DNA难度加大,更无法进行个人识别鉴定。卵膜糖蛋白,也叫透明带(zona pellucida,ZP)是一种包裹在哺乳动物卵母细胞周围的糖蛋白半透明基质,在受精过程中起着至关重要的作用。在人类中,ZP由四种糖蛋白组成,分别为ZP1、ZP2、ZP3和ZP4。其中,hZP3是精卵识别结合的初级受体,在受精过程中,与精子结合,诱发精子一系列反应,包括精子膜活化、酪氨酸磷酸化和顶体反应等,在精卵结合、顶体反应、防止多精入卵以及保护卵细胞和着床前的胚胎等方面发挥着重要的作用。hZP3的功能肽段,氨基酸序列214-305aa,(命名为Truncated ZP3(TrZP3))是诱导精子顶体反应的关键肽段。研究已经证明重组hZP3和TrZP3在结构和功能上与天然ZP3接近,可以进行与精子在体外结合的研究。在生殖学领域相关的研究中更多关心的是获能精子,研究精子-卵细胞或者精子-ZP的体外结合。然而,法医物证领域涉及的生物检材混合斑中的精子多是未获能的,因此,提取这种未获能精子是本研究的关键问题。既往对于重组hZP3和TrZP3与未获能精子在体外结合尚未有报道。本研究将瞬时表达重组hZP3和稳定表达功能截断TrZP3,探究与未获能精子在体外的结合,为法医学领域的性犯罪案件中提取精子提供一种实用的方法和相关理论基础。法医物证学在解决个人识别和亲权鉴定问题中应用的DNA遗传标记经历了可变数目串联重复序列(variable number of tandem repeat,VNTR)、短串联重复序列(short tandem repeat,STR)、单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)这几代遗传标记后,插入/缺失(Insertion/Deletion,InDel)近年来在DNA分型中也开始逐渐在法医学领域中受到重视。InDel具有突变率低、稳定性好、多态性高、PCR扩增片段短等特点,可以弥补STR和SNP在这些方面的应用缺陷。国内外有研究报道开发出InDel检测系统的试剂盒,但是由于不同人群在不同地域存在遗传结构差异,造成试剂盒的检测率偏低,因此,有必要针对中国北方人群的遗传结构特点,发明适用的InDel试剂盒并应用于司法鉴定中。本研究中选取了三个常染色体的InDel,包括ACE、DJ-1和GIGYF2基因,计算其法医学参数,为针对中国北方汉族建立InDel检测体系提供有效数据,以及为将来法医学领域在基因水平上应用遗传学方法进行个人识别和亲子鉴定提供可靠依据。帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是常见的神经退行性疾病。某些遗传因素和环境因素已被证明会导致PD,但是病因仍然不明确。有研究已经揭示了一些候选遗传标记与PD在不同人群中的关系,但InDel与PD的相关性报道较少。有研究表明,这三个InDel可能与PD发病风险相关,因此我们也分析了这三个位点的InDel多态性与PD的相关性,为PD的发病机制提供有效数据。研究方法:1、本研究选取真核细胞系HEK293为研究对象,瞬时转染重组质粒pCDNA-3.1(+)-ZP3-6His,应用蛋白免疫印迹法检测表达是否成功。2、应用Ni-NTA亲和层析法纯化融合蛋白hZP3-6His。3、纯化后的融合蛋白hZP3-6His与未获能精子在体外孵育,通过免疫荧光实验和抑制实验检测结合效果。4、选取真核细胞系CHO-K1为研究对象,构建稳定表达EGFP-TrZP3-6His融合蛋白的CHO细胞系,蛋白免疫印迹法在蛋白水平上检测表达是否成功。5、通过激光共聚焦显微镜观察稳定细胞系细胞48 h内生长的形态和荧光强度变化。6、通过间接细胞免疫荧光方法检测在细胞水平上融合蛋白EGFP-TrZP3-6His是否成功表达。7、应用Ni-NTA亲和层析法纯化融合蛋白EGFP-TrZP3-6His。8、采用抑制实验检测纯化后的融合蛋白EGFP-TrZP3-6His与未获能精子在体外结合的数量依赖性和时间依赖性。9、采用酚-氯仿法提取中国北方汉族PD病例组和对照组的基因组DNA。10、设计这三个InDel位点的特异性引物,进行PCR和电泳。11、统计InDel位点的基因型和基因频率分布,计算法医学参数以及分析与PD发病风险的相关性。结果:1、真核细胞系HEK293成功表达融合蛋白hZP3-6His。2、亲和层析法纯化获得了融合蛋白hZP3-6His。3、纯化的融合蛋白hZP3-6His和未获能精子体外结合的实验,在免疫荧光实验中未检测到,而抑制实验结果显示一定程度的差异。4、成功构建稳定表达ZP3(214-305aa)的CHO细胞系。5、亲和层析法纯化获得了融合蛋白EGFP-TrZP3-6His。6、抑制实验方法未能检测到纯化后的融合蛋白EGFP-TrZP3-6His与未获能精子体外结合的数量依赖性和时间依赖性。7、在GIGYF2的InDel位点上等位基因X和等位基因5比较(OR=1.378,95%CI=1.112-1.708,P=0.003)以及基因型5/X+X/X与和基因型5/5比较时(OR=1.681,95%CI=1.174-2.407,P=0.004)具有统计学意义;然而,ACE和DJ-1的InDel位点上无明显差异。8、分层后均不具有性别与PD发病风险的统计学意义。9、ACE和GIGYF2 InDel位点的DP>0.5,为具有较高鉴别能力的遗传标记。结论:1、成功表达和纯化融合蛋白hZP3-6His和融合蛋白EGFP-TrZP3-6His。2、未发现融合蛋白hZP3-6His或者融合蛋白EGFP-TrZP3-6His与未获能精子在体外的结合。3、GIGYF2的InDel可能与中国北方PD风险增加有关。4、ACE和GIGYF2 InDel位点可以在法医学领域的个人识别和亲子鉴定中应用。