人可溶性生长刺激表达基因2蛋白的真核表达及多克隆抗体的制备

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人生长刺激表达基因2(suppression of tumorigenicity 2,ST2)蛋白是IL-1受体家族成员,通过IL-33-ST2蛋白信号通路发挥作用,参与多种疾病的发生发展。可溶性ST2(soluble ST2,sST2)蛋白不仅可以作为心力衰竭的诊断及疗效监测的指标,还可以协助诊断自身免疫性疾病、慢性阻塞性肺病、过敏性哮喘等疾病并评估病情严重程度。临床上采用价格昂贵的进口ELISA法试剂检测血清中可溶性ST2蛋白浓度,反映其表达水平。目的:构建人sST2蛋白的重组真核表达载体,体外表达人sST2;优化人sST2蛋白的表达和纯化条件,以获得高纯度的人sST2重组蛋白;制备鼠源性多克隆抗体。方法:利用ECM培养基稳定培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC),根据NCBI上人sST2的基因序列设计引物,利用RT-PCR技术获得人sST2基因;经琼脂糖凝胶电泳鉴定、DNA胶回收、连接T载体、基因测序、质粒回收、酶切鉴定等步骤,构建人sST2/pcDNA3.1-his(-)重组真核表达载体;lipo 2000脂质体法将表达载体转染非洲绿猴肾细胞(COS7),RT-PCR法观察不同转染试剂浓度、不同转染时间对人sST2重组蛋白表达的影响,并用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白;用western blot和ELISA法对人sST2重组蛋白进行鉴定。纯化后的人sST2重组蛋白用蔗糖浓缩法提高浓度;与等体积的佐剂一起充分研磨乳化,皮下注射免疫Balb/c小鼠,定期采集小鼠眼眶血液,并分离血清,采用ELISA法测抗体效价。结果:ECM培养基成功培养HUVEC,TRIZOL法提取细胞总RNA,逆转录PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳分析,结果显示产物长度与预期一致,约为1 000 bp;同源性比对分析结果显示,人sST2(1 002 bp)基因成功插入PGH-T载体;用核酸内切酶BamHⅠ和HindⅢ对sST2/pcDNA3.1-his(-)重组真核表达载体双酶切后凝胶电泳分析,结果显示产物电泳位置与预期一致。用lipo 2000试剂将重组表达载体转染COS7细胞,RT-PCR法扩增目的基因,琼脂糖凝胶电泳结果显示:24 h内,24孔板中lipo 2000试剂浓度在2 ul/孔时转染效率最高,且此时不会因为转染试剂浓度过大而造成细胞的大量死亡。收集细胞培养上清液,经镍柱亲和层析法纯化人sST2重组蛋白,SDS-PAGE电泳结果显示在约为65KDa处有一明显条带,与预期蛋白位置一致;western blot结果显示人sST2重组蛋白有His标签,sST2 ELISA试剂检测结果显示人sST2重组蛋白有与抗sST2抗体结合的特异性抗原表位。人sST2重组蛋白免疫Balb/c小鼠,经三次免疫后,五只小鼠的血清抗体效均>1:32 000。结论:成功构建人sST2/PGH-T重组克隆载体和人sST2/pcDNA3.1-his(-)重组真核表达载体。人sST2重组蛋白以可溶性形式存在于细胞培养上清液中,通过镍柱亲和层析法能成功对其纯化。人sST2重组蛋白具有很强的免疫原性,能获得高效价的鼠源性多克隆抗人sST2蛋白抗体。
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