【摘 要】
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背景:本研究所按照胃肿瘤Ming氏分型的标准,分别成功建立了浸润型（XGC-1）和膨胀型（XGC-2）胃肿瘤细胞株。研究前期对具有不同生长方式来源的细胞系构建小鼠原位移植瘤模型,并剖离胃组织进行脂质组学研究,通过深度挖掘数据信息以及运用多种生物信息学分析方法,我们总结了二者之间在脂代谢方面存在差异性。其中,在肿瘤自噬调节方面我们发现,浸润型相对于膨胀型胃肿瘤具备更大程度的自噬作用,结合实验室已获得
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背景:本研究所按照胃肿瘤Ming氏分型的标准,分别成功建立了浸润型（XGC-1）和膨胀型（XGC-2）胃肿瘤细胞株。研究前期对具有不同生长方式来源的细胞系构建小鼠原位移植瘤模型,并剖离胃组织进行脂质组学研究,通过深度挖掘数据信息以及运用多种生物信息学分析方法,我们总结了二者之间在脂代谢方面存在差异性。其中,在肿瘤自噬调节方面我们发现,浸润型相对于膨胀型胃肿瘤具备更大程度的自噬作用,结合实验室已获得的转录组数据,将进一步探究两型胃肿瘤自噬作用的差异及相关分子机制。之前的研究报告表明这两者在临床上具有不同的预后表现,我们推测自噬作用的差异或许可以作为解释这种现象的参考依据。因此,本论文在不同生长方式胃肿瘤组织脂质组学研究基础之上,结合胃肿瘤细胞的分子生物学实验加以验证,以期得到可靠的论证。目的:1.基于不同生长方式胃肿瘤细胞脂质组学差异,研究在药物化疗作用下,XGC-1和XGC-2两者自噬作用发生,并且对比这两种不同生长方式胃肿瘤细胞存在的自噬差异。2.与转录组学数据关联分析,找到自噬差异相关的关键分子Ambral,通过敲低细胞内Ambra1表达,研究自噬作用改变影响胃肿瘤细胞药物作用的效果以及探讨自噬作用是否是造成XGC-1和XGC-2不同耐药表现的原因。方法:1.体外培养XGC-1、XGC-2细胞,分别在1μM的多柔比星（Doxorubicin,DOX）或与100nM巴弗洛霉素（Bafilomycin A1,BafA1）的联合运用下,通过导入mCherry-GFP-LC3荧光质粒,在不同时间点观察自噬的现象。再以Western Blot的实验方法,对自噬相关蛋白Beclin1、LC3、P62以及CathepsinD进行检测,判断药物化疗对自噬的影响,同时对比XGC-1、XGC-2自噬作用的差异性。2.针对自噬调控重要基因Ambral,以RNA干扰的方法分别对XGC-1、XGC-2细胞的Ambra1表达水平进行下调,再以CCK-8细胞增殖-毒性实验,流式细胞凋亡实验以及凋亡相关蛋白PARP和Caspase3的测定对比因自噬改变而产生的细胞药物反应的变化。在此基础上,比较XGC-1、XGC-2胃肿瘤细胞的细胞凋亡实验结果和自噬程度的关系,验证自噬对XGC-1、XGC-2不同肿瘤耐药性的影响。结果:1.多柔比星（Doxorubicin,DOX）对胃肿瘤细胞的化疗作用可以诱导肿瘤细胞产生自噬作用,其自噬程度与药物作用的时间呈现正相关。且XGC-1相对于XGC-2胃肿瘤细胞表现出更大水平的自噬作用。2.针对自噬调控基因Ambra1的干扰敲低,我们发现在XGC-1、XGC-2中,shAmbra1组相较于阴性对照组都可以明显抑制自噬,而且增加了凋亡相关蛋白PARP 和 Caspase3 的表达。3.另外,在对阴性对照组和shAmbra1组的XGC-1、XGC-2胃肿瘤细胞采用的较大剂量10 μM多柔比星（Doxorubicin,DOX）处理作用的CCK-8细胞增殖-毒性实验和流式细胞凋亡实验,结果显示shAmbral组的胃肿瘤细胞表现出更大的细胞凋亡水平。而在阴性对照组的XGC-1、XGC-2胃肿瘤细胞,XGC-1表现出更大的细胞耐药作用。讨论:在运用RNA干扰技术对自噬调节基因Ambra1进行敲低表达可以下调自噬的作用,我们发现抑制自噬可有效增强两种不同胃肿瘤细胞的药物化疗效果。换言之,胃肿瘤细胞在化疗过程中,自噬作用对细胞的耐药起着促进作用。而XGC-1和XGC-2胃肿瘤细胞因其自噬作用的强弱差异,导致了细胞抵抗压力环境的能力不同。这可能也从侧面解释了两型不同生长方式的胃肿瘤临床预后差异的原因,同时也表明自噬作用的差异可能与Ambra1的表达差异密切相关。我们的研究是基于在对两种不同生长方式的胃肿瘤组织关于脂质组学方面的研究基础上进行的,脂质组学在生命科学领域具有宽广的应用价值,无论在临床医学诊断关于生物标记物的发现还是疾病的病理机制以及病因归属的研究应用上都将发挥着独特的作用。
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